系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達系列分析文庫的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、第一部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達系列分析文庫的構(gòu)建 目的：構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達系列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)文庫 方法：采集3個家族性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血各5ml，混合在一起提取單個核細胞。采用三處改良的SAGE技術(shù)構(gòu)建SAGE文庫，三處改良分別為1)用交聯(lián)有oligo(dT)25的磁珠直接抽提mRNA，并在同一反應管內(nèi)進行雙鏈c

2、DNA的合成和NlaⅢ酶切，避免了原始SAGE方法中兩次酚/氯仿抽提、乙醇沉淀造成的DNA損失。2)進行二次PCR擴增。即在第一次100bp標簽擴增純化后，再行一次短循環(huán)數(shù)的PCR擴增，以獲得足量的純度相對較高的100bp標簽。3)利用零背景的pZErO(R)-1質(zhì)粒進行克隆，提高了效率。隨機挑選237個轉(zhuǎn)化菌克隆進行菌落PCR鑒定，以了解重組體是否轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化菌及插入片段的大小。對部分陽性克隆進行測序，驗證插入片段是否符合SAGE標簽排列

3、方式。 結(jié)果：從3個家族性紅斑狼瘡患者外周血各5ml中共分離出1.6×106個單個核細胞。初步構(gòu)建的SAGE文庫已獲得600個克隆，隨機取237個克隆進行菌落PCR分析，其中216個克隆中質(zhì)粒插入片段大于250bp，占91％。每個重組體中插入標簽為數(shù)十個不等，以10-40個標簽為多。對部分克隆測序證實插入的串聯(lián)體序列為數(shù)百個堿基以CATG間隔，兩個CATG之間約有20個堿基，其堿基序列排列方式符合SAGE標簽排列。 結(jié)論

4、：對SAGE技術(shù)進行了改良，使之可應用于含RNA量少的組織或細胞。應用改良SAGE的技術(shù)成功構(gòu)建了系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞SAGE文庫，可了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達譜，并為篩選系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者差異表達基因奠定了基礎(chǔ)。 第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達系列分析文庫的初步分析 目的：研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達模式。 方法：構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞基因表達

5、系列分析文庫完成后，隨機選取98個克隆進行大規(guī)模標簽(tag)測序，得到的98個測序文件用SAGE2000V4.5軟件分析其標簽表達的特點。登陸http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGEmap網(wǎng)站，下載人類SAGE標簽參考數(shù)據(jù)庫，將初步獲得的標簽序列與人類SAGE標簽參考數(shù)據(jù)庫相比較，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞的SAGE標簽對應的基因信息。登陸http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE

6、map網(wǎng)站，將系統(tǒng)性紅斑狼瘡外周血單個核細胞SAGE文庫中表達豐度位于前30的單配對標簽提交查詢，獲得相對應的基因信息。 結(jié)果：對98個克隆進行測序，獲得1814個SAGE標簽，由1286個序列不同的獨立標簽組成。這些標簽中，單拷貝占86.6％，2-19拷貝占13％，僅0.2％的標簽多于20拷貝。能與已知基因相配的標簽占68.4％，其中41.1％能與多個基因匹配；31.6％的標簽不能和已知基因配對，它們可能代表新基因。表達豐度為