頸動脈神經干細胞移植治療腦出血后遺癥的時間窗及療效的動物實驗研究.pdf

1、目前關于神經干細胞的移植方法及移植時間仍存在爭議。腦實質內單個或多個位點直接注射的移植方法，易造成局部腦損傷；移植的細胞集中在注射局部腦組織內，不利于細胞在腦組織內的分布；另外，細胞暴露于病灶的炎性環(huán)境中，存活率明顯降低。腦室內移植可使細胞較為廣泛分布于腦內，但創(chuàng)傷較大而且必須克服血腦屏障及腦脊液．腦屏障的限制。經尾靜脈神經干細胞移植，簡單易于操作、侵襲性小，移植的細胞能夠特異性的遷移到病理位置。首過效應，細胞被中樞神經系統(tǒng)以外的組織所

2、攝取，以及隨血液循環(huán)時長時間暴露于網狀內皮及免疫系統(tǒng)，導致其移植效率降低。另外，經皮頸動脈注射能夠高效的將藥物導入局部病灶，易于操作、并且創(chuàng)傷小。因此在本實驗中，我們將體外擴增的BrdU標記的鼠胎腦神經干細胞，通過頸動脈注射入膠原酶(Ⅶ型)/肝素誘導建立的腦出血動物模型，研究頸動脈神經干細胞移植對腦出血的治療作用和細胞移植效率，從而尋找一個高效的、侵襲性較小的神經干細胞的移植方法。 實驗方法： 1．取孕14天的Wistar

3、胎鼠，解剖顯微鏡下取出胚胎大鼠大腦皮層。0.25﹪胰蛋白酶/0.02﹪EDTA(1:1)消化后，吸管輕輕吹打，使大部分組織塊分散成單個細胞或小細胞團狀態(tài)。離心后，棄上清，洗滌沉淀細胞2次。加入神經干細胞完全培養(yǎng)液，臺盼藍活細胞計數，以1×10<'5>cells/ml濃度進行神經干細胞原代培養(yǎng)。 分別采用機械分離與胰酶消化神經球的分離方法進行NSCs傳代培養(yǎng)，臺盼藍活細胞計數測定分離后細胞存活率，觀察不同傳代方法對神經干細胞的損傷

4、作用。 繪制神經干細胞生長曲線，計算細胞倍增時間，研究不同傳代方法對神經干細胞增殖能力的影響。 采用機械分離或胰酶消化的方法連續(xù)傳代、長期穩(wěn)定培養(yǎng)神經干細胞，計算細胞增殖率，比較研究長期培養(yǎng)條件下，不同傳代方法對神經干細胞增殖率的影響。 取第4代、8代、12代、20代以及30代，穩(wěn)定的機械分離傳代培養(yǎng)的神經干細胞球接種到24孔培養(yǎng)板中的蓋玻片上，加入神經干細胞分化培養(yǎng)液進行分化培養(yǎng)，研究長期培養(yǎng)條件下神經干細胞的

5、神經發(fā)生能力的變化。 2.50只Wistar大鼠隨機分為試驗組和生理鹽水對照組。實驗組25只大鼠，應用立體定向紋狀體內注射膠原酶(Ⅶ型)/肝素方法建立ICH模型。10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，應用微量注射泵將0.7μl生理鹽水/0.14UⅣ型膠原酶/1.4U肝素緩緩注射入尾狀核內(冠狀縫后0.2mm，外側3.0mm，腹側6.0mm)。生理鹽水對照組25只大鼠，僅接受腦內注入等量生理鹽水。 手術后2小時及每天對實驗組和對照組

6、大鼠進行行為功能測試，檢測其神經功能缺損情況。 術后1天，3天，5天，7天，實驗組與對照組分別處死5只大鼠，斷頭取腦，距離針道前后2mm．冠狀切取腦組織，觀察血腫形態(tài)、水腫情況，計算腦組織含水量。 試驗結束后，處死各組最后5只大鼠；常規(guī)HE染色，觀察出血腦組織顯微病理改變。 3．取穩(wěn)定培養(yǎng)傳至4-6代的神經干細胞，移植前三天于培養(yǎng)基中添加BrdU(5gmol/l)標記細胞，用于追蹤遷移、存活于宿主體內的移植細胞。

7、移植前收集神經干細胞球，胰酶消化分離為單細胞，重懸為1×10<'4>cells/μl的細胞懸液以備移植。取膠原酶(Ⅶ型)/N：素誘導建立的48只Wistar大鼠ICH模型，隨機分為實驗組和對照組。實驗組大鼠分別在ICH后2、7、14、21、28天進行頸動脈NSCs移植(400μl DMEM，含4×10<'6>NSCs)。對照組8只大鼠，僅接受頸動脈內注入等量DMEM培養(yǎng)液。 腦出血后1天和移植后每周對實驗組和對照組大鼠進行行為功

8、能評價。 于腦出血后2月處死所有動物，斷頭取腦，冰凍切片，行免疫熒光單、雙標染色鑒別移植來源的細胞，觀察細胞遷移、分布及分化情況。 計算機輔助計數(ImagePro；Media Cybergenics，Silvet Spring，MD)腦組織內的BrdU陽性移植細胞，半定量計算宿主腦內的移植細胞數以及來源于移植細胞的MAP-2、GFAP陽性細胞數。 行HE染色測定各組大鼠腦出血病灶體積大小，評估神經干細胞移植后對

9、腦出血病灶大小改變的影響。 實驗結果： 1．原代和傳代培養(yǎng)的細胞球呈nestin陽性，并且能夠分化為MAP．2陽性的神經元、GFAP陽性的星形膠質細胞及MBP陽性的少突膠質細胞，證實成功培養(yǎng)獲得具備自我更新和多向分化能力的神經干細胞。 與胰酶消化法進行神經干細胞球傳代相比，逐步減小吸管口徑機械分離大細胞球為小細胞球和單細胞的傳代方法，傳代后細胞存活率高(p<0.05)，細胞倍增時間短，增殖能力強。 體外長

10、期培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，神經干細胞分化為神經元的比例逐漸降低，星形膠質細胞的比例逐漸增高；然而，在4代到12代之間神經干細胞分化為神經元的能力雖然表現出下降的趨勢，但仍較為穩(wěn)定，培養(yǎng)至12代之后，神經元的分化比例迅速下降，星形膠質細胞的比例迅速上升。 2．實驗組大鼠術后左側肢體癱瘓，前后肢行動遲緩，抓持能力減弱，活動時向右側旋轉和/或左側傾倒，穿越橫梁時，行動時間顯著延長或不能穿越掉下橫梁，24小時之內功能缺損達到頂峰

11、。與之相比，對照組大鼠術后僅可見輕微功能損害，于1天之內逐漸恢復。兩組之間存在顯著統(tǒng)計學差異(p<0.0001)。 術后第一天，實驗組大鼠右側尾狀核區(qū)形成一明顯圓形或橢圓形的血腫，血腫周邊有一狹窄而不規(guī)則的水腫帶。術后2-4天時，周圍水腫十分明顯，隨后逐漸減輕。對照組大鼠僅術后最初2天可見注射點周圍較狹窄范圍輕微水腫，未觀察到血腫形成。實驗組大鼠腦組織含水量顯著高于對照組大鼠腦組織含水量(p<0.001) 腦組織切片HE染色，實

12、驗組大鼠血腫區(qū)內充滿大量的紅細胞，其中可見血腫破壞腦組織；血腫周圍的腦組織疏散，細胞水腫，星形膠質細胞腫脹，神經細胞變性壞死，很多中性粒細胞、小膠質細胞充盈其中。對照組大鼠未見明顯異常。 3．腦出血后第9周始，與對照相比，NSCs移植組大鼠行為功能改善明顯(ANOVAp<0.05)，SNK檢驗顯示，腦出血第7天移植組在移植后第3周和ICH后第9周的行為功能評分顯著優(yōu)于其他時間移植組(p<0.05)；在同一時間點上，ICH后第2天

13、和第14天接受移植大鼠行為功能評分低于晚期接受移植組，而第14天接受移植組大鼠行為功能改善又好于第2天接受移植組大鼠(p<0.05)；第21和第28天移植組大鼠未見明顯治療效果(p>0.05)，兩組間亦未有顯著性差異(p>0.05)。 BrdU標記的移植細胞遷移進入并存活于宿主腦內；并且絕大多數移植細胞選擇性的靶向遷移到損傷區(qū)，較為均勻的分布于血腫周邊腦組織；少數細胞分布于對側半球及同側正常腦組織內。 遷移并存活于宿主腦

14、內的Brdu陽性移植細胞數量取決于移植時間。ICH后第7天和第14天移植組BrdU陽性細胞計數顯著多于ICH后第2天、第21天和第28天移植組，且第7天移植組多于第14天移植組。 移植的BrdU陽性細胞分化為GFAP陽性星形膠質細胞和MAP-2陽性神經元，未觀察到移植細胞分化為MBP陽性少突膠質細胞。 細胞的分化方向與移植時間明顯相關。與其他時間移植的細胞相比，ICH后第2天移植的NSCs絕大部分分化為星形膠質細胞(84

15、.5±7.6﹪)，少部分細胞分化為神經元(8.6±1.3﹪)；而ICH后第21和27天移植的NSCs分化為神經元的比例明顯增大(35.4±3.1﹪，37.2±4.1﹪)，分化為星形膠質細胞的比例相應減少(52.1±6.5﹪，50.3±5.7﹪)。然而，7-14天移植組，分化為神經元的絕對數量顯著高于其它治療組(p<0.0001)。 與對照相比，移植組大鼠病灶體積未見明顯縮小(p>0.05)，提示NSCs移植在腦出血后第8周未能有

16、效修復病灶體積。 結論： 1．與胰酶消化法相比，應用逐步減小吸管口徑機械分離大細胞球為小細胞球和單細胞的分離傳代方法，減少了傳代對細胞的損傷，保證了大部分細胞間連接的完整性，顯著增強神經干細胞的增殖能力。體外長期擴增的神經干細胞，由于微環(huán)境和/或自身基因的調控，隨著傳代的延續(xù)，其神經發(fā)生能力逐漸降低：分化為神經元的比例逐漸減少，分化為星形膠質細胞的比例逐漸增加。 2．Ⅶ型膠原酶/肝素尾狀核內立體定向注射的方法，制

17、作ICH動物模型，術后大鼠產生明顯的、長期行為功能障礙，不同的個體之間神經病學評分差距較小，并且血腫形態(tài)較為一致，對于研究腦出血后神經功能的恢復和治療療效評價有利。 3．由于腦出血后病灶周圍血腦屏障的破壞、細胞因子的表達；頸動脈注射后局部細胞濃度梯度的作用以及神經干細胞對顱內病理改變的趨向作用，經皮頸動脈神經干細胞移植能夠靶向的、高效的將神經干細胞移植至病灶周圍，并且創(chuàng)傷小、手術簡單易于操作。 神經干細胞移植時間影響移植