EB病毒與細胞因子HGF協(xié)同影響鼻咽癌血管生成和細胞黏附的研究.pdf

1、鼻咽癌是高發(fā)于中國南方和東南亞地區(qū)的惡性腫瘤性疾病。在生物學行為方面，鼻咽癌細胞生長迅速，常于發(fā)病早期即發(fā)生鄰近部位的侵襲和淋巴結的轉(zhuǎn)移，在臨床上，幾乎四分之三的鼻咽癌患者在初次就診時就已伴有淋巴結轉(zhuǎn)移。在組織病理學方面，于流行區(qū)高發(fā)的非角化性癌組織中常常伴有大量的淋巴細胞浸潤，淋巴細胞究竟在此過程中扮演何種角色，是否如一般所理解的淋巴細胞可以免疫性殺傷腫瘤細胞而保護機體，還是相反起著促進腫瘤細胞演化、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用?這既是鼻咽癌組織

2、形態(tài)上的特點，實際上也是鼻咽癌發(fā)展演進的關鍵性問題，同時還關系到腫瘤的臨床治療和預后。 對鼻咽癌的病因?qū)W研究己明確EB病毒是導致鼻咽癌的一類致癌病毒。EBV又名人類皰疹病毒IV型，是一種雙鏈DNA病毒，是人皰疹病毒科γ亞科中唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒。很多研究證據(jù)已經(jīng)證實，EBV是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的一種關鍵因素。EBV的基因結構復雜，可編碼多種蛋白，參與病毒的感染、轉(zhuǎn)化和致病。EBV編碼的潛伏膜蛋白-1是一種重要的蛋白，是

3、EBV參與鼻咽癌上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化唯一相關的癌蛋白。但是，EBV轉(zhuǎn)化鼻咽黏膜上皮細胞，導致鼻咽癌的發(fā)生、演進是一個非常復雜的過程，目前還有很多機制不明。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成并分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)，它們介導細胞之間的信息交換與相互調(diào)節(jié)，參與免疫應答與炎癥反應過程。細胞因子的作用具有多功能性和通用性，細胞因子之間可相互協(xié)同或拮抗。近年來發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤，如鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、胃癌、

4、肺癌、肝癌、乳腺癌等均有細胞因子表達水平的改變。在腫瘤發(fā)生、組織修復、細胞分化和增殖中起重要作用。鼻咽癌細胞和間質(zhì)中的淋巴細胞均可以分泌多種細胞因子，這些細胞因子對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是否有重要作用，目前尚未明確。 肝細胞生長因子是一種多肽生長因子，具有促進細胞分裂、組織成形，誘導上皮細胞遷移、侵襲以及誘導血管生成等作用。原癌基因met編碼的c-Met蛋白屬于生長因子受體類，是至今唯一被認識的HGF高親和力受體，并可在多種腫瘤細胞中

5、過表達。HGF/c-Met的過表達與腫瘤不良預后、侵襲深度和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，可作為腫瘤的危險因素指標。HGF/c-Met對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是否有重要作用，正是值得注意但又尚未研究的問題。 血管生成是腫瘤細胞獲得營養(yǎng)的前提條件，淋巴管和微血管數(shù)量增加也加大了腫瘤細胞進入循環(huán)系統(tǒng)的機會，導致腫瘤轉(zhuǎn)移機率增加。腫瘤微血管生成與多種血管生成因子的表達相關。IL-8是一類中性粒細胞趨化因子，具有多種功能：促進血管生成，誘導某些腫瘤細胞

6、移動、增殖，促使細胞表達黏附分子，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。但在鼻咽癌組織中，IL-8表達上調(diào)的機制至今尚未明了。 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)，以及腫瘤細胞之間相互作用的結果。細胞黏附在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用。鼻咽癌早期發(fā)生組織侵襲和淋巴結轉(zhuǎn)移的特點一直受到關注，但其機制至今仍不清楚。在與腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移相關的諸多因素中，上皮型鈣黏素的作用越來越顯示出重要性。在人類多種腫瘤組織中，ECD表達缺失或降低

7、都表明其與腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移有關，但其作用和調(diào)控的分子機制尚未完全明確。 盡管有線索提示EBV與HGF/c-Met系統(tǒng)在多種人類腫的發(fā)生、演進過程中起到了協(xié)同作用，但結論尚不肯定。不同類型的腫瘤，以及腫瘤所處的不同臨床分期，都有可能影響EBV感染與HGF/c—Met系統(tǒng)的相互作用關系，從而導致不一致的研究結果。在鼻咽癌的發(fā)生演進過程中，EBV和HGF/c—Met系統(tǒng)是否起到協(xié)同促進作用，目前尚無研究，本研究的目的是通過研究這兩

8、個因素在鼻咽癌血管生成、細胞黏附性等方面的協(xié)同關系而探討其對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響。 材料與方法：收集2000年11月-2005年11月中山大學附屬第一醫(yī)院診斷明確未經(jīng)治療的鼻咽癌病例60例，采用免疫組化染色方法檢測鼻咽癌組織中HGF、c-Met、LMP-1、IL-8、CD34、ECD的表達。將組織蠟塊制作成組織芯片，采用EBV探針原位雜交試劑盒進行原位雜交檢測，分析鼻咽癌組織中EBERs的表達情況。 培養(yǎng)鼻咽癌細胞株CN

9、E-2、C666和EBV轉(zhuǎn)化的永生化猴淋巴細胞B95.8。分別抽提基因組DNA，采用PCR方法擴增細胞內(nèi)EBV BamH Ⅰ-W片段，以確定細胞株EBV感染狀況。另外，采用不同濃度外源性細胞因子HGF體外誘導CNE-2、C666細胞株，用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-8的濃度，用免疫細胞化學染色和RT-PCR方法檢測相關蛋白的表達狀況；進行細胞黏附實驗，觀察不同濃度外源性細胞因子HGF對細胞黏附性的影響。 結果：

10、1.本研究收集的60例鼻咽癌病例標本，男性41例(68.33％)，女性19例(31.67％)，發(fā)病年齡29～73歲，平均年齡45.3歲。其中角化性鱗狀細胞癌4例(6.67％)，分化型非角化性癌14例(23.33％)，未分化型非角化性癌42例(70.00％)。60例鼻咽癌組織中，15例(25.00％)癌細胞呈Schmincke型生長方式，23例(38.33％)呈Regaud型生長方式，混合型為22例(36.67％)。 2.EBER

11、s表達陽性率為93.34％(56/60)。絕大多數(shù)癌細胞胞核均可見EBERs陽性信號，浸潤前期病變(包括鼻咽被覆上皮或隱窩上皮不同程度不典型增生和原位癌)亦可見到數(shù)量不等的異型細胞呈EBERs陽性表達。 3.鼻咽癌組織中細胞因子HGF主要在癌巢周圍間質(zhì)淋巴細胞中表達，陽性率為75.00％(45/60)，28.33％(17/60)的病例癌細胞亦呈HGF陽性，遠低于HGF在間質(zhì)淋巴細胞中的表達(P<0.01)。鼻咽癌組織中c-Met

12、表達陽性率為85.00％(51/60)。LMP-1表達陽性率為36.67％(22/60)。IL-8表達陽性率為45.00％(27/60)。ECD表達陽性率為71.67％(43/60)。 4.細胞因子HGF在以Schmincke型生長方式的癌細胞中的表達水平明顯高于以Regaud型生長方式的癌細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，但與其它臨床病理指標則均無明顯聯(lián)系。 5.癌巢周圍間質(zhì)淋巴細胞表達的HGF與癌細胞表達的H

13、GF呈正相關關系(rs=0.292，P=0.023)；淋巴細胞表達的HGF與癌細胞表達的c-Met呈正相關關系(rs=0.469，P=0.000)；癌細胞表達的HGF與c-Met呈正相關關系(rs=0.893，P=0.000)；癌細胞表達的LMP-1與IL-8呈正相關關系(rs=0.509，P=0.000)，癌細胞表達的c-Met和癌組織微血管密度呈正相關關系(rs=0.276，P=0.033)。另外，癌細胞LMP-1和淋巴細胞HGF同

14、時表達病例的癌細胞IL-8表達明顯增高(P<0.01)。 6.鼻咽癌組織的平均微血管密度為14.88±6.15/高倍視野。癌巢周圍間質(zhì)淋巴細胞HGF表達陽性組的微血管密度(16.06±6.12/高倍視野)高于HGF表達陰性組(11.35±5.13/高倍視野)，P=0.010；癌細胞IL-8表達陽性組微血管密度(16.40±4.25/高倍視野)高于IL-8表達陰性組(13.37±5.91/高倍視野)，P=0.046。 7.

15、EBV BamH I-W片斷PCR結果證實：CNE-2為EBV感染陰性株、C666為EBV感染陽性株。 8.CNE-2、C666細胞株在不同濃度外源性細胞因子HGF處理后24小時后，免疫細胞化學染色顯示ECD表達未出現(xiàn)差異性改變。 9.CNE-2細胞株在不同濃度的外源性細胞因子HGF處理24小時后，上清液中IL-8濃度明顯上升；但C666細胞株在HGF處理后，培養(yǎng)上清IL-8濃度未出現(xiàn)差異性改變。 10.RT-P

16、CR結果顯示，CNE-2和C666細胞株在外源性細胞因子HGF刺激后c-Met表達水平均增加。但無論細胞因子HGF刺激與否，CNE-2和C666細胞株均不表達內(nèi)源性HGF。C666細胞株表達LMP-1，但其表達水平在細胞因子HGF刺激前后無顯著性差異。 11.外源性細胞因子HGF刺激能增加CNE-2細胞株的細胞．基質(zhì)黏附性，但對C666細胞株的細胞．基質(zhì)黏附性影響卻不明顯。 結論： 1.EBV在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中起

17、重要作用，鼻咽癌前驅(qū)病變已經(jīng)有EBV感染。 2.EBV編碼的LMP-1蛋白可能通過上調(diào)鼻咽癌組織中細胞因子IL-8的表達，促進腫瘤內(nèi)微血管生成，在癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中起作用。 3.鼻咽癌間質(zhì)淋巴細胞產(chǎn)生的外源性細胞因子HGF可能通過旁分泌途徑激活鼻咽癌細胞受體c-Met，上調(diào)鼻咽癌組織中IL-8表達，促進腫瘤內(nèi)新生微血管形成；并可能通過非ECD途徑改變癌細胞的黏附性，從而在癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。 4.鼻咽