脂聯(lián)素基因修飾的脂肪組織基質(zhì)血管組分細(xì)胞移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 1.構(gòu)建并鑒定含人脂聯(lián)素(Human adiponectin，Human adipose mostabundant gene transcript1，HapM1)基因的重組慢病毒載體； 2.從大鼠脂肪組織中分離、培養(yǎng)具干細(xì)胞標(biāo)志的基質(zhì)血管組分( Stromalvascular fraction，SVF)細(xì)胞，HapM1基因修飾SVF細(xì)胞；檢測HapM1在SVF細(xì)胞中的表達(dá)； 3.探討HapM1基因修飾的S

2、VF細(xì)胞移植對大鼠心肌梗死的影響，觀察移植細(xì)胞的存活、分化情況。 方法: 1.HapM1基因重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 (1)根據(jù)Genbank中HapM1基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，通過TA克隆篩選正確的重組體，進(jìn)行酶切鑒定和測序。 (2)通過雙酶切和基因重組亞克隆構(gòu)建HapM1重組慢病毒載體質(zhì)粒pNL- HapM1-IRES2-EGFP，經(jīng)抗生素篩選后，進(jìn)行酶切

3、鑒定和測序。 2.HapM1基因修飾SVF細(xì)胞 (1)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，收集病毒進(jìn)行超速離心濃縮。PCR鑒定病毒基因組中目的基因HapM1的插入。 (2)通過膠原酶消化分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法在體外提取、傳代培養(yǎng)大鼠脂肪組織中的SVF細(xì)胞，并經(jīng)免疫熒光法檢測CD31、CD34表達(dá)情況。 (3)將慢病毒感染SVF細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(

4、Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表達(dá)，細(xì)胞RT-PCR檢測HapM1的mRNA表達(dá)，Western blot檢測HapM1蛋白的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測所表達(dá)HapM1蛋白的生物學(xué)活性。 3.HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞移植對心肌梗死的療效觀察 (1)結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立大鼠心肌梗死模型，觀察心電圖變化驗(yàn)證模型的成功與否，然后心肌局部移植基因修飾的SVF細(xì)胞。

5、 (2)移植4周后通過超聲心動圖及血流動力學(xué)檢測評定心功能。 (3)心臟切片HE染色觀察各組大鼠心肌的組織學(xué)變化。 (4)熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活和分布，通過CTNI抗體的免疫熒光染色觀察移植細(xì)胞在心肌中的分化情況，通過HapM1抗體的免疫熒光染色觀察目的蛋白在心肌中的表達(dá)情況，通過對Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫熒光檢測測定血管內(nèi)皮密度。 結(jié)果: 1.獲得了長度為735bp的HapM1目的基因片段，

6、HapM1基因重組慢病毒載體質(zhì)粒pNL-HapM1-IRES2-EGFP經(jīng)雙酶切后凝膠電泳鑒定正確，測序結(jié)果與Genbank報(bào)道序列完全一致。 2.HapM1基因修飾SVF細(xì)胞 (1)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞包裝慢病毒后熒光顯微鏡下觀察可見較強(qiáng)綠色熒光，重組慢病毒經(jīng)PCR鑒定有目的基因條帶。 (2)通過膠原酶消化分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法獲得了SVF細(xì)胞，免疫熒光檢測顯示CD31陰性、CD34陽性。 (

7、3) SVF細(xì)胞受慢病毒感染后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，RT-PCR、Western blot檢測到有HapM1轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，所表達(dá)的HapM1蛋白具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的生物學(xué)活性。 3.HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞移植對心肌梗死的療效觀察 (1)經(jīng)SVF細(xì)胞移植治療的心肌梗死大鼠的心臟功能和組織學(xué)的恢復(fù)都好于對照組。HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞移植治療的心肌梗死大鼠心臟功能和組織學(xué)恢復(fù)狀況明顯優(yōu)于單純SVF細(xì)胞治療

8、組。 (2)移植的SVF細(xì)胞可存活于心肌缺血損傷部位。EGFP標(biāo)記的SVF細(xì)胞移植后在缺血心肌組織中有局部分布。 (3)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)部分的SVF細(xì)胞表達(dá)心肌的特異標(biāo)志物CTNI。 (4)免疫熒光染色顯示，SVF細(xì)胞移植后心梗區(qū)心肌組織Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)明顯增高。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建含目的基因HapM1和報(bào)告基因EGFP的重組慢病毒載體pNL-HapMI-IRES2-EGFP，成功包裝含目的基

9、因HapM1的重組慢病毒。 2.成功對SVF細(xì)胞進(jìn)行HapM1基因修飾，功能基因HapM1和報(bào)告基因EGFP在SVF細(xì)胞上均獲得表達(dá)，為HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞治療研究提供直觀的檢測手段。 3.HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞有HapM1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，所表達(dá)的HapM1蛋白具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的生物學(xué)活性。 4.HapM1基因修飾的SVF細(xì)胞可在心肌損傷部位存活，分化表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物。 5.H