轉錄因子SOX2促進人喉癌上皮細胞Hep-2惡性表型的機制及相關信號通路研究.pdf

1、前言：
　　喉癌是頭頸部常見癌癥之一，喉癌的預后給患者帶來了極大的痛苦。喉鱗狀細胞癌是一種最常見的喉癌類型，極易發(fā)生頸部的淋巴結轉移。研究報道，干細胞轉錄因子SOX2的表達異常參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進程。在對喉癌患者的喉癌組織研究中證實SOX2的高表達促進喉癌的發(fā)生和發(fā)展進程，但目前SOX2在該過程中發(fā)生作用的具體分子機制仍然不清楚，有待于進一步深入研究。
　　基于癌細胞無限增殖、轉化和轉移的特點，給癌癥的治愈帶來很大

2、的難度。腫瘤的轉移是引起腫瘤的發(fā)病率和死亡率重要原因。研究證明SOX2參與多種腫瘤細胞的侵襲和轉移，但卻發(fā)揮雙重作用。在胃癌和肺癌的研究中發(fā)現，SOX2的高表達降低了兩種癌細胞的侵襲和轉移能力;然而在乳腺癌和肝內膽管細胞癌中，SOX2的高表達卻發(fā)揮了相反的作用。目前還未見高表達SOX2對喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞遷移和侵襲能力的影響的報道。研究證實MMP-2在腫瘤轉移中發(fā)揮作用，高表達SOX2后是否會影響MMP-2的表達和活性，進而影響

3、喉癌細胞的轉移，仍需進一步研究以闡明高表達SOX2對喉癌細胞增殖和遷移的作用機制。
　　研究表明，PI3K/AKT信號通路參與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，該通路與腫瘤的增殖、凋亡、轉移和侵襲等多個細胞過程有關。PI3K-AKT信號通路成為鼻咽癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌等多種癌癥治療的靶點。研究表明PI3K/AKT信號通路的異?；罨c喉鱗癌的發(fā)生有關。在人前列腺癌細胞的研究中發(fā)現PI3K/AKT信號通路參與SOX2

4、的表達。而且研究發(fā)現有藥物可以通過PI3K/AKT途徑抑制Hep-2細胞增殖并誘導其凋亡。但在Hep-2細胞中，SOX2是否通過PI3K/AKT途徑介導細胞的增殖和遷移，未見報道。
　　本實驗分為三部分，首先通過分子生物學手段構建重組質粒pEGFP-N1-SOX2，通過脂質體2000將重組質粒轉染到喉癌細胞Hep-2中，構建SOX2基因穩(wěn)定轉染細胞株，為研究SOX2基因在喉癌中的作用建立良好的實驗平臺。然后對Hep-2細胞過表達S

5、OX2對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響進行研究。同時檢測了喉癌細胞SOX2過表達后對MMP-2的表達和活性影響，并通過siRNA干擾下調MMP-2表達和MMP-2抗體處理SOX2過表達Hep-2細胞，進一步驗證了MMP-2與細胞遷移和侵襲能力的關系，明確了SOX2高表達促進細胞遷移和侵襲的作用機制。最后，用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002處理SOX2過表達細胞，檢測SOX2過表達對Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR在

6、細胞中表達的影響，Transwell檢測細胞侵襲能力的變化。最終明確SOX2在喉癌細胞Hep-2中是否通過PI3K/Akt信號通路促進細胞的遷移和侵襲，為治療和預防喉癌的轉移和侵襲發(fā)現了新的靶點，并提供理論依據。
　　一、SOX2基因穩(wěn)定轉染喉癌細胞株(Hep-2)的建立
　　目的：構建重組質粒pEGFP-N1-SOX2，脂質體轉染法構建SOX2過表達穩(wěn)轉Hep-2細胞系，為研究SOX2在喉癌發(fā)生的機制及信號通路研究構建良好

7、的實驗平臺。方法：PCR進行SOX2基因擴增，TA克隆和測序后獲得SOX2基因片段，雙酶切、連接和轉化后，挑取白色單菌落進行PCR菌落初步鑒定，用酶切反應進一步鑒定，最終通過測序確定重組質粒pEGFP-N1-SOX2構建正確。調整Hep-2細胞狀態(tài)，通過脂質體2000將質粒轉染到Hep-2中，實驗分為細胞分為空白對照組(Hep-2)、空載體對照組(vector)和SOX2過表達組(SOX2)。使用600 g/mlG418的DMEM完全培

8、養(yǎng)基進行單克隆細胞株的篩選。篩選后的單克隆細胞置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件下中進行培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，初步鑒定SOX2過表達穩(wěn)轉Hep-2細胞系是否構建成功。通過Real-time PCR、Western blot和免疫熒光實驗從不同角度共同驗證各組細胞SOX2的表達情況。結果：成功的構建了重組表達載體pEGFP-N1-SOX2。質粒轉染后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達。通過Real-time

9、PCR、Western blot和免疫熒光實驗檢測結果顯示，對照Hep-2組，vector組細胞SOX2表達與前者表達變化不大，SOX2組細胞SOX2在mRNA和蛋白水平顯著表達(p＜0.01)。結論：成功的構建了過表達SOX2基因穩(wěn)定轉染喉癌Hep-2細胞株。
　　二、過表達SOX2對喉癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響
　　目的：研究SOX2過表達后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力的變化以及對侵襲轉移相關蛋白MMP-2的表達和

10、活性的影響，明確過表達SOX2影響細胞增殖和遷移能力的機制。方法：質粒轉染細胞，實驗分為空白對照組（Hep-2）、空載體對照組(vector)和SOX2過表達組(SOX2)?？寺⌒纬蓪嶒灆z測各組細胞克隆形成率，MTT實驗檢測各組細胞增殖情況，Western blot檢測增殖相關蛋白PCNA和Cyclin D1的表達。通過劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力，Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力。Real-time PCR和Wester

11、n blot檢測各組細胞MMP-2的表達，明膠酶譜法檢測各組細胞MMP-2的活性。通過siRNA使SOX2過表達細胞MMP-2的表達下調，實驗分為空白對照組(SOX2)、陰性對照組(control siRNA)和MMP-2沉默組(MMP-2 siRNA)。Western blot檢測各組細胞MMP-2的表達，劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，Transwell實驗細胞的侵襲能力。利用0.1μg/mlanti-MMP-2抗體和IgG抗體處理SO

12、X2過表達細胞，實驗分為空白對照組(SOX2)、IgG對照組(IgG)和anti-MMP-2組(anti-MMP-2)。劃痕實驗檢測藥物處理各組細胞12h和24 h的遷移能力，Transwell實驗檢測藥物作用各組細胞24 h的侵襲能力。結果：質粒轉染細胞后，與Hep-2組相比，SOX2組細胞克隆形成率、細胞增殖率、PCNA和Cyclin D1的表達水平、細胞遷移率和細胞侵襲個數顯著提高(P＜0.01)，而vector組與對照組各指標差

13、異不大。相對Hep-2組，SOX2過表達后通過Real-time PCR和Western blot檢測細胞中MMP-2的表達水平顯著上調（P＜0.01），明膠酶譜法發(fā)現MMP-2的活性顯著提高（P＜0.01）。無論是RNAi使過表達SOX2細胞中MMP-2表達下調還是使用anti-MMP-2處理SOX2過表達細胞，相對于SOX2組，細胞的遷移和侵襲能力均下調。結論：SOX2過表達后促進Hep-2細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時伴隨著MM

14、P-2表達的上調和活性的增加。揭示SOX2可能通過介導MMP-2的表達影響細胞的遷移和侵襲能力。
　　三、過表達SOX2對喉癌細胞中PI3K-Akt信號通路的影響
　　目的：通過Western blot檢測PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑LY294002處理pEGFP-N1-SOX2細胞后Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR的表達情況，Transwell檢測LY294002處理后對SOX2過表達細胞的侵襲能力的影響

15、，明確Hep-2細胞SOX2過表達后是否介導PI3K-AKT信號通路促進細胞惡性表型的發(fā)生。方法：用20μM的LY294002和DMSO分別處理pEGFP-N1-vector和pEGFP-N1-SOX2兩組細胞，處理30 min后，收集細胞用于transwell和western blot的檢測。實驗分為:vector+DMSO組、SOX2+DMSO組、vector+LY294002組和SOX2+LY294002組。Western blo

16、t檢測各組細胞Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR蛋白的表達，Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力。結果：LY294002處理細胞后，無論是對于轉染空載體的細胞還是SOX2穩(wěn)定表達的細胞，p-Akt和p-mTOR蛋白較LY294002處理前表達下調，而Akt和mTOR在LY294002處理前后幾乎沒有發(fā)生變化。與SOX2+DMSO組相比，LY294002處理SOX2過表達細胞后，細胞的侵襲能力顯著下降（P＜0.01）。結論