阻斷STAT3信號通路對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機制.pdf

1、目的：探討胰腺癌組織中信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達情況及其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系；應用Janus激酶(JAK)抑制劑AG490和STAT3特異性小干擾RNA表達載體阻斷STAT3信號通路，探討阻斷STAT3信號通路對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用及其可能機制。 方法： ⑴免疫組織化學方法檢測34例胰腺癌和10例正常胰腺組織中STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、基質(zhì)金屬蛋白

2、酶-2 (MMP-2) 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達。 ⑵細胞侵襲測定試劑盒檢測人胰腺癌細胞株SW1990和CaPan-2的體外侵襲力；Western blot檢測SW1990 和CaPan-2細胞中STAT3、p-STAT3蛋白的表達；電泳遷移率實驗(EMSA)檢測SW1990 和CaPan-2細胞中STAT3的DNA結(jié)合活性。應用AG490處理SW1990 和CanPan-2細胞，細胞侵襲測定試劑盒檢測細胞體外侵

3、襲力的改變，Western blot檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達的變化，EMSA檢測STAT3的DNA結(jié)合活性的變化， Western blot和RT-PCR分別檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)基因蛋白和mRNA表達的變化。 ⑶構(gòu)建三條STAT3特異性小干擾RNA(siRNA)表達載體，并瞬時轉(zhuǎn)染SW1990細胞，RT-PCR和Western blot觀察STAT3 siRNA表達載體對SW1990細胞中STAT3的抑制作用。選擇最為有效

4、的STAT3 siRNA表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW1990細胞，細胞侵襲測定試劑盒和裸鼠體內(nèi)急性血路轉(zhuǎn)移模型觀察SW1990細胞STAT3沉默前后侵襲轉(zhuǎn)移能力的改變。RT-PCR和Western blot分別檢測SW1990細胞STAT3沉默前后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因mRNA和蛋白表達的改變。 結(jié)果： ⑴免疫組化發(fā)現(xiàn)p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌組織中存在高表達，p-STAT3、MMP-2和MMP-9表達均與臨床分期及淋

5、巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。P-STAT3與MMP-2的表達呈正相關(guān)，p-STAT3與MMP-9的表達亦呈正相關(guān)。 ⑵體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)SW1990細胞比CaPan-2細胞具有更高的侵襲力。高侵襲力細胞株SW1990中存在p-STAT3蛋白的高表達，而低侵襲力細胞株CaPan-2中呈低表達；EMSA實驗亦證實SW1990細胞的STAT3的DNA結(jié)合活性明顯比CaPan-2細胞高。用AG490處理48h后，對CanPan-2細胞的侵襲力無明顯影響

6、，但可明顯抑制SW1990細胞的侵襲力，且隨AG490濃度升高，SW1990細胞的侵襲力抑制愈強。AG490可明顯抑制SW1990細胞中p-STAT3蛋白表達和STAT3的DNA結(jié)合活性。AG490處理SW1990細胞48h后，MMP-2和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的蛋白和mRNA表達均明顯下調(diào)，且其表達隨著AG490濃度增大而有逐漸降低的趨勢。 ⑶成功構(gòu)建三條STAT3 siRNA表達載體（pRNAT-STAT3 siRNA

7、-I，pRNAT-STAT3 siRNA-II，pRNAT-STAT3 siRNA-Ⅲ）和陰性對照表達載體pRNAT-Con。三條STAT3 siRNA表達載體瞬時轉(zhuǎn)染SW1990細胞后，STAT3的mRNA以及蛋白的表達量與未轉(zhuǎn)染組相比均明顯下降，其中pRNAT-STAT3 siRNA-II組中mRNA和蛋白的表達水平分別比未轉(zhuǎn)染組下降了78.5％和71.8％。選擇STAT3 siRNA表達載體pRNAT-STAT3 siRNA-II

8、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW1990細胞，G-418持續(xù)篩選，建立穩(wěn)定表達STAT3 siRNA的長期基因沉默的細胞SW1990-RNAi-a 和SW1990-RNAi-b。體外侵襲實驗和體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗表明SW1990-RNAi-a 和SW1990-RNAi-b細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力較SW1990親代細胞明顯下降。RT-PCR和Western blot顯示SW1990-RNAi-a 和SW1990-RNAi-b細胞中MMP-2和VEGF的mRNA和蛋白表達較

9、SW1990親代細胞均明顯下調(diào)。 結(jié)論： ⑴ p-STAT3、MMP-2和MMP-9在胰腺癌組織中存在高表達，且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；p-STAT3與MMP-2和MMP-9的表達呈正相關(guān)。STAT3可能通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。 ⑵ STAT3活性與胰腺癌細胞的侵襲力密切相關(guān)；AG490阻斷STAT3活化可通過下調(diào)MMP-2和VEGF表達，抑制胰