聚酰胺-胺與聚乙烯亞胺共聚物及其葉酸修飾的基因傳遞系統(tǒng)的構建及性能評估.pdf

1、人類目前很多疾病用傳統(tǒng)的治療方法，手段和技術很難治愈或者難達到較好的治療效果。隨著人類基因工程計劃的完成，分子生物學及其技術的發(fā)展，人們可以從基因水平去認識疾病，發(fā)現致病基因，實現基因治療的可能?；蛑委熅褪菍⑼庠葱灾委熁蛲ㄟ^載體傳送到病變的組織或細胞，沉默非正常的基因表達，替換或者修復有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。由于單純的裸基因在傳遞的過程中容易被體內的一些生物酶降解而失去治療作用，因此基因需要載體的傳送。研究表明，載體的

2、類型往往決定基因的傳遞效率，從而決定著治療的效果。因此，發(fā)展有效的基因載體是發(fā)展基因治療的必由之路。此外，病毒載體還有制造成本高，制備復雜，基因協載量低等問題?；谶@些問題，很多研究將目標轉向了非病毒基因載體的研究。非病毒載體可以克服病毒載體的安全性問題，但是其傳遞效率低于病毒載體，往往很難達到滿意的治療效果。因此，發(fā)展高效的，高安全性的非病毒載體用于基因治療非常必要。其中，陽離子聚合物聚酰胺-胺(polyamidoamine，PAMA

3、M)和聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是兩類研究比較多的非病毒基因載體。一般地，高代數的PAMAM和大分子量的PEI都具有高的轉染效率，但是伴隨著很大的細胞毒性;相反，低代數的PAMAM和小分子量的PEI具有很低的細胞毒性，但伴隨著很低的轉染效率，而且這兩類載體的抗血清能力非常的差，用于臨床試驗具有很大的挑戰(zhàn)。
　　另一方面，載體要用于體內基因治療必須具有一定的穩(wěn)定性和靶向能力。聚乙二醇化(PEGylatio

4、n)常常被用來提高載體的穩(wěn)定性，降低載體與體內陰離子型物質的非特異性結合，延長體內循環(huán)時間。另外，PEG還常用作配體和載體的連接劑，既可以保持PEG的優(yōu)點，同時還可以增加配體-受體結合的能力。雖然這樣的策略在一定程度上提高了系統(tǒng)的膠束穩(wěn)定性和細胞特異性，但是PEG的修飾同樣存在一些問題，主要是:降低載體的細胞攝取和溶酶體中逃逸的能力。因此，本研究的重要之二是:構建PEG-配體修飾的PAMAM-PEI靶向基因傳遞系統(tǒng)，然后嘗試通過優(yōu)化PE

5、G末端配體密度去克服PEG作用降低的細胞攝取和進一步提高載體的轉染活力和細胞特異性。
　　根據上面的敘述，我們將論文分成2個部分，第一部分是合成PAMAM-PEI共聚物，對其轉染活力和細胞毒性進行評估，初步考察它們的基因傳遞機制。第二部分工作是根據第一部分的結果去構建一種轉染活力更高、毒性更低的PAMAM-PEI的共聚物，然后以此共聚物為基礎構建葉酸靶向的基因傳遞系統(tǒng)。
　　在研究的第一部分，我們將生物兼容性好的PAMAM

6、G1.5和G2.5與毒性低的分支狀PEI1800 Da通過酰胺化反應合成一種以PAMAM為核，PEI為外層的PAMAM-PEI(PAPE)共聚物。通過紅外，核磁，GPC對其結構進行了表征。然后考察了PAPE對DNA的壓縮能力，復合物的抗核酸酶降解能力，并對PAPE/DNA復合物的粒經，電位，形態(tài)進行了測定。對復合物在不同細胞系上的轉染效率，毒性進行了評估。最后對其在HEK293T細胞上的轉染機制進行了初步研究。具體的內容如下:
　

7、　(1)以PAMAM G1.5或G2.5為核心，與過量的分支狀PEI1800通過酰胺化反應合成PAMAM為核，PEI為外層的PAMAM-PEI共聚物。以PAMAMG1.5和G2.5為核的共聚物分別被命名為PAPE-1和PAPE-2.用紅外(FT-IR)，核磁(1H NMR)和凝膠滲透色譜(GPC)對其結構進行表征。結果顯示，在PAPEs的紅外和核磁圖譜上沒有PAMAM G1.5和G2.5上的甲酯(-COCH3)特征峰，這是由于PAMAM

8、和PEI發(fā)生了酰胺化反應生成了酰胺鍵導致其消失，且甲酯基全部參與了反應。
　　(2)PAPEs/pDNA復合物生物理化性質的研究。利用凝膠電泳對PAPEs的基因壓縮能力進行了評估，發(fā)現，PAPE-1和PAPE-2在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移，能力和PEI25K相當，但稍弱于PAMAM G5.利用核酸酶降解實驗來考察PAPE對DNA的保護能力，發(fā)現PAPEs在N/P=2時開始呈現出保護能力且隨著N/P的升高而增強。

9、　　(3)對PAPEs/DNA復合物在不同細胞系上的轉染活力分別在有無血清的條件下進行了評估。HEK293T的轉染結果表明，PAPEs的轉染活力是隨著N/P的升高先提高再降低的，在無血清的條件下最優(yōu)比是N/P=25，有血清條件下的最優(yōu)轉染比是N/P=90.在N/P=25時，PAPEs的轉染活力顯著高于PEI25K，PAMAM G5，PEI1800的最優(yōu)轉染效率，但是弱于商業(yè)化轉染試劑Lipofectamine2000(P＜0.05)。<

10、br>　　(4)利用細胞途徑抑制劑來研究PAPEs/DNA進入細胞的機制，利用共聚焦顯微鏡(CLSM)來觀察復合物進入細胞后其在胞內的分布位置，利用溶酶體突破試劑-氯喹來驗證復合物是否通過溶酶體，利用aphidicolin對細胞的分裂進行抑制研究細胞分裂對轉染效率的影響。結果表明，PAPEs/DNA復合物進入細胞主要是caveolae-mediated pathway(CvME)途徑。CLSM觀察到大部分復合物沒有與溶酶體重疊共定位在一

11、起而且接近細胞核的邊緣，這說明大部分復合物不經過溶酶體;為了進一步證實這個現象，細胞轉染前用氯喹預處理以促進載體逃離溶酶體從而提高轉染效率，但是復合物的轉染效率不能提高，這說明復合物具有足夠的緩沖能力突破溶酶體或者復合物不經過溶酶體。
　　在本文的第二部分，鑒于第一部分的結果PAPE高效的基因傳遞效率，這很可能歸功于它的結構優(yōu)勢，雖然研究也發(fā)現它們的細胞毒性雖然較PEI25K低，但是它的安全濃度范圍相對較窄，濃度在30μg/mL就

12、可以使HeLa細胞喪失～30％的細胞活力，因此我們首先研究了其結構和轉染效率、毒性間的關系，期望發(fā)現轉染效率更高和毒性更低的PAMAM-PEI共聚物。由于陽離子聚合物的毒性是和分子量是成正比的，所以我們采用支化的小分子PEI423去替代PEI1800與PAMAM G2.5反應合成一種具有薄PEI外層的新型的PAMAM-PEI雜交體(PME)，然后對其毒性和轉染活力進行了評估。結果表明，PME在所測細胞系上均表現出比PAPE-2更高的轉染

13、效率(P＜0.05）同時也具有抗血清的能力，但同時它的細胞毒性顯著低于PAPE-2(P＜0.05)。然后，為了進一步提高PME的細胞特異性，我們用PEG，FA1-PEG和FA2-PEG對其進行化學修飾，合成了具有相同PEG取代度但不同葉酸密度的PME作為靶向基因載體，同時考察葉酸密度對提高PME的轉染活力和細胞特異性的影響。利用1H NMR和UV對其結構進行了表征。它們對基因的壓縮能力，復合物的粒徑電位進行了測量，考察了它們的細胞毒性和

14、溶血性，利用流式細胞儀對其轉染效率和細胞攝取進行了測定，對其細胞攝取的機制用抑制劑進行了評估，最后比較了它們在HEK293T多細胞球體上的攝取。具體的研究內容如下:
　　(1)PAMAM G2.5與過量的PEI423通過酰胺化反應合成PAMAM G2.5-PEI423(PME).用FT-IR,1H NMR和GPC對其結構進行了表征，結果表明，PME被成功合成。然后對其在多種細胞上的轉染活力進行了測定，與PAPE-2相比，PME的轉

15、染活力更高(P＜0.05)。它們對細胞的毒性大小進行析因分析后發(fā)現載體的類型對細胞活力有顯著影響(F=485.861，P=.000)，在每個濃度進一步單獨比較，發(fā)現PME的細胞活力顯著高于PAPE-2(P＜0.05)。
　　(2)利用瓊脂糖凝膠電泳對共聚物的基因壓縮能力進行了評估，結果表明PEGylation沒有顯著影響PME的基因壓縮能力，所有的共聚物在N/P=2時可以完全阻滯DNA的遷移。利用馬爾文粒徑儀對復合物的粒徑和電位進

16、行了測量。
　　(3)共聚物轉染活力的評估。對葉酸受體陽性細胞HEK293T和HeLa細胞轉染規(guī)律是:PME經PEG化后轉染效率顯著降低（P＜0.05），當PEG的末端連上1價FA分子后，轉染效率顯著提高(P＜0.05），當PEG的末端連接上2價的FA分子之后，轉染效率再次提高(P＜0.05）。
　　(4)細胞攝取機制的研究。利用游離葉酸和細胞攝取通道抑制劑研究PME-(PEG3.4k-FA2)1.72，PME-(PEG3.

17、4k-FA1)1.66，PME-(PEG3.5k)1.69復合物的細胞攝取機制。葉酸受體陽性細胞經游離葉酸預處理后，細胞表面的葉酸受體將被飽和。
　　通過本研究主要得出:1）PAPE具有很高的轉染活力和相對低的細胞毒性，復合物進入細胞主要通過小窩蛋白調控的內吞作用，此途徑可以減少復合物進入溶酶體的量避免被降解，細胞分裂時的核運輸，基因表達的規(guī)律近似符合玻爾茲曼模型函數;2）利用小分子PEI423替代PEI1800與PAMAM G2