利用定向蛋白組學液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)對乳腺癌耐藥相關(guān)膜蛋白的定量分析研究.pdf

1、目的:乳腺癌化療過程中多藥耐藥性的高發(fā)和膜蛋白相關(guān)，其中包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor, TfR)。有研究表明P-gp蛋白能夠?qū)⒒熕幬飶娜橄侔┠[瘤細胞內(nèi)泵出到細胞外，它的過度表達與腫瘤多藥耐藥相關(guān)。TfR蛋白參與鐵的吸收并在細胞生長和細胞增殖方面發(fā)揮作用，已有很多文獻報導TfR蛋白在許多種癌癥包括乳腺癌中過度表達并且耐藥細胞和產(chǎn)生耐藥的乳腺癌組織中表達量

2、更多。準確定量測定乳腺癌中P-gp蛋白和TfR蛋白的含量將有助于改善腫瘤的早期檢測診斷和預(yù)測乳腺癌患者的化療效果及預(yù)后評估。
　　方法:利用基于LC-MS/MS的定向蛋白組學液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)建立對P-gp蛋白和TfR蛋白定量檢測的方法，用于測定乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中P-gp蛋白和TfR蛋白的含量。
　　結(jié)果:1.434STTVQLMQR442，674GSQAQDR680和368IIDNKPSIDSYSK380這三個肽段是P-

3、gp蛋白胰蛋白酶水解的特異性肽段，選取434STTVQLMQR442代替P-gp蛋白作為研究目標物進行定量，建立P-gp蛋白定量檢測MRM條件，采用內(nèi)標法用穩(wěn)定同位素標記的肽段STTV*QLMQR為內(nèi)標物并準確測定了乳腺癌細胞系MCF-7/WT和乳腺癌耐藥細胞系MCF-7/ADR中P-gp蛋白的含量。實驗結(jié)果與傳統(tǒng)的免疫學方法的結(jié)果進行對比，包括激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫印跡和流式細胞術(shù)。最后，利用建立的定量方法對60對產(chǎn)生化療藥物耐受的

4、乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中的P-gp蛋白含量進行了定量檢測。
　　2.選取681VEYHFLSPYVSPK693代替TfR蛋白本身作為研究目標物進行定量，建立TfR蛋白定量檢測MRM條件，采用內(nèi)標法用穩(wěn)定同位素標記的肽段V*EYHFLSPYVSPK為內(nèi)標物。質(zhì)量控制數(shù)據(jù)結(jié)果顯示可接受的準確度和精密度范圍，最后利用建立的方法準確測定了三個乳腺癌細胞系和36對乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中TfR蛋白的含量。實驗結(jié)果與激光共聚焦技術(shù)

5、、蛋白免疫印跡、流式細胞術(shù)和組織免疫化學方法所得結(jié)果進行比較。
　　結(jié)論:基于定向蛋白組學的液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能準確定量細胞和臨床組織樣本中的P-gp蛋白和TfR蛋白，并能應(yīng)用于低濃度的臨床樣本的測定。這種方法為將來大規(guī)模測定大分子生物標志物提供了一種可能。
　　總而言之，液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析手段具有快速經(jīng)濟、定量限低、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點，尤其是在測定低濃度以及生物樣本時更能得到較為可靠的數(shù)據(jù)。實踐證明，液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠