我國(guó)間日瘧原蟲(chóng)分離株Duffy抗原結(jié)合蛋白基因多態(tài)性分析.pdf

1、目的：探討我國(guó)瘧疾混合流行區(qū)間日瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期候選抗原Duffy抗原結(jié)合蛋白(DBP)Ⅱ區(qū)基因多態(tài)性特點(diǎn)。 方法：從我國(guó)瘧疾高發(fā)混合流行區(qū)云南省采集瘧疾患者末梢血，制備血樣干濾紙片，QIAamp DNA mini kit(QIAGEN，德國(guó))試劑盒提取間日瘧原蟲(chóng)基因組DNA。根據(jù)間日瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)株Sal—Ⅰ株DBPⅡ區(qū)為目的擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)特異性引物，以間日瘧原蟲(chóng)基因組DNA為模板，采用高保真DNA聚合酶(KOD-Plus聚合酶，Toy

2、obo，日本)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DBPⅡ區(qū)基因。對(duì)擴(kuò)增所得片段純化后，用美國(guó)ABIPRIME測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序。Sal—Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)株作為參照，利用BIOEDIT軟件對(duì)所獲得的基因序列進(jìn)行排序(alignment)分析，檢測(cè)基因突變位點(diǎn)。以DnaSP4.50.3(http：//www．ub．es．dnasp/)和MEGA4.0軟件評(píng)估序列多態(tài)性。 結(jié)果：1、擴(kuò)增了19個(gè)間日瘧原蟲(chóng)DBPⅡ區(qū)(PvDBP RⅡ)基因序列600b

3、p長(zhǎng)度片段(堿基位點(diǎn)853～1452bp)，編碼200個(gè)氨基酸(密碼子285～484)。2、我國(guó)間日瘧原蟲(chóng)云南分離株與Sal—Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)株(Cent ral American株)比較，堿基水平共有13處發(fā)生突變，占2.17％(13/600)，導(dǎo)致12個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，占6.00％(12/200)，其中A1134→G位點(diǎn)為同義突變，未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變；核苷酸改變共產(chǎn)生9種基因型，相應(yīng)產(chǎn)生9種氨基酸型，以A1151G—G1169A-T

4、1270A基因型(相應(yīng)氨基酸型為D384G—R390H—L4241)為主(26.3％)。在堿基和氨基酸水平上未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。3、與國(guó)內(nèi)外瘧疾流行區(qū)PvDBP RⅡ氨基酸多態(tài)位點(diǎn)的觀察比較顯示，我國(guó)云南株P(guān)vDBP RⅡ氨基酸置換位點(diǎn)基本包含于國(guó)外報(bào)道的位點(diǎn)中，未發(fā)現(xiàn)地區(qū)特異性突變位點(diǎn)。4、核苷酸序列多態(tài)性分析結(jié)果顯示π=0.0091(SE：0.0028)；dn/ds=6.168(P<0.05)；Tajima's D=1.21360(P

5、>0.10)；Fu and Li's D*=1.48091(P<0.05)，F(xiàn)*=1.62640(P<0.05)。 討論：1.比較我國(guó)(云南、浙江和湖北)分離株的結(jié)果與南美、中東地區(qū)PvDBP RⅡ的基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，我國(guó)分離株P(guān)vDBP RⅡ基因突變位點(diǎn)相對(duì)有限，提示我國(guó)分離株紅內(nèi)期候選抗原DBP蛋白功能相對(duì)保守。2.本研究結(jié)果顯示，云南地區(qū)的PvDBP RⅡ的突變位點(diǎn)較浙江和湖北地區(qū)報(bào)道的位點(diǎn)，新發(fā)現(xiàn)3處突變位點(diǎn)，但發(fā)生頻率均

6、較低，這對(duì)分析我國(guó)不同流行區(qū)間PvDBP RⅡ基因多態(tài)性具有一定的提示意義。另外本研究還發(fā)現(xiàn)N417K和W437R位點(diǎn)呈關(guān)聯(lián)出現(xiàn)，提示針對(duì)該靶位開(kāi)發(fā)的多價(jià)疫苗也可能對(duì)我國(guó)流行區(qū)有效。3.分析我國(guó)云南分離株P(guān)vDBP RⅡ的基因多態(tài)性的原因，可能整體上受到自然選擇的影響，呈正向選擇趨勢(shì)。我國(guó)云南分離株P(guān)vDBP RⅡ基因多態(tài)性突變位點(diǎn)的一些特點(diǎn)及影響多態(tài)性的可能因素分析，可為以PvDBP RⅡ?yàn)榛A(chǔ)建立有效傳播阻斷疫苗的研究提供一定的線(xiàn)索