pSUPER載體介導的siRNA抑制肝癌多藥耐藥基因mrp1的表達.pdf

1、目的:①構建pSUPER-shRNA/mrp1的表達載體，為探討體內、體外抑制肝細胞癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)多藥耐藥基因(Multidrug resitance，MDR)表達的方法提供實驗基礎。②觀察pSUPER-shRNA/mrp1對HepG2/mrp1細胞生長的影響作用，研究mrp1基因的功能。③探討pSUPER-shRNA/mrp1對HepG2/mrp1細胞MDR抑制作用及其作用的機理。④觀察p

2、SUPER-shRNA/mrp1對活體HepG2/mrp1細胞移植瘤的抑制作用及初步探討其毒副作用。 方法:從GenBank查mrp1基因序列，L05628，利用InvivoGen公司提供的計算機設計軟件，根據(jù)siRNA的設計原則，尋找合適的siRNA靶序列，采用BLAST軟件，對選擇的靶序列進行同源分析，排除非特異性地抑制其他基因片段的可能，從mrp1基因中選擇5段各21個堿基的特異性靶序列，分別設計5組寡核苷酸鏈，第5組是對

3、照組。每條寡核苷酸包括：兩端用于形成酶切位點的序列，兩個反向互補排列的21nt mrp1特異性序列，中央被一個9nt的間區(qū)隔開，用于形成莖環(huán)結果，每條鏈64nt退火后形成兩端各帶Bgl Ⅱ、HindⅢ位點的dsRNA。將5組dsRNA分別重組到pSUPER載體構建P1、P2、P3、P4、P5表達載體，PCR初步篩選重組子，質粒測序確定堿基序列正確的重組載體。構建成功后的表達載體轉染HepG2、HepG2/mrp1細胞株和皮下接種于裸鼠的

4、移植瘤。進行一系列的細胞和動物實驗：①觀察轉染pSUPER-shRNA/mrp1對HepG2/mrp1細胞生長的作用；②用RT-PCR、Western blot雜交測定細胞mrp1基因轉錄后其mRNA的水平和MRPl蛋白表達水平；③流式細胞術分別檢測MRP1蛋白的表達水平和細胞內柔紅霉素(DNR)積累量；④MTT法檢測轉染后細胞的耐藥性；⑤裸鼠成瘤實驗，觀察HepG2、HepG2/mrp1細胞成瘤情況；⑥腫瘤治療實驗，瘤內注射pSUPE

5、R-shRNA/mrpl、pSUPER-shRNA/mrplnegative vectors，質粒載體0.75mg/kg，和腹腔內注射ADM1.5mg/kg，觀察裸鼠及腫瘤生長及腫瘤抑制率情況；⑦藥物毒副作用試驗，檢測并比較轉染前后裸鼠肝腎功能及白細胞變化，并做心、肝、腎、肺組織解剖病理學檢查。 結果:①成功合成重組質粒pSUPER-shRNk/mrp1載體P1、P2、P3、P4、P5并可以有效地進行體外、動物體內轉染，說明pS

6、UPER-shRNA/mrpl能直接細胞內合成、表達siRNA，有好的穩(wěn)定性，以P4效果最好；②轉染pSUPER-shRNA/mrpl的HepG2/mrp1細胞，P4組mrp1 mRNA轉錄水平下調(88.03±2.04)％，多藥耐藥相關蛋白MRP1的表達量下降至(10.2±1.3)％，相對逆轉效率89.2％，細胞內DNR積累量明顯增加；③成功建立裸鼠肝癌種植瘤模型，成瘤率均為100％；④裸鼠肝癌種植瘤經(jīng)轉染pSUPER-shRNA/m

7、rp1，ADM化療前后實驗組腫瘤體積差613.24±28.58mm<'3>，腫瘤生長率(10.35±1.26)％，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義[1120.04±90.76&(17.90±4.58)％，P<0.05]，腫瘤抑制率達45.0％；⑤D、E、F三組裸鼠均行肝腎功能及血液常規(guī)檢測，及心、肝、腎、肺病理學檢查。結果顯示，組間均無明顯差異，顯示pSUPER-shRNA/mrpl體內轉染抑制HepG2/mrp1特定基因mrpl的表達，