冷誘導金針菇原基形成的相關基因研究.pdf

1、金針菇(Flammulina velutipes)是一種低溫型食用菌，其原基的形成和子實體的發(fā)育需要經過10~13℃的低溫刺激。冷誘導金針菇原基形成過程受到一些功能基因的調控，找到并研究這些相關基因的調控機理具有重要的意義。組氨酸激酶基因和GATA Zinc finger轉錄因子在冷誘導金針菇原基形成過程中起著至關重要的作用。組氨酸激酶是雙組分系統(tǒng)的一種，當植物受到低溫刺激時，自身能夠啟動感受低溫信號和將信號傳導出去的信號通路，將外界的

2、低溫信號傳遞到細胞內，并誘導相應基因的表達。GATA Zinc finger是一類重要的轉錄因子，其普遍具有鋅指結構，在植物的生長發(fā)育和冷誘導機制的信號傳導途徑中起著重要的調控作用。
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年發(fā)展起來的一種新型基因編輯技術，目前被廣泛的運用到多種生物中進行基因改造。CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要一個具有核酸酶功能的Cas9蛋白，和一個具有識別及定位功能的sgRNA就可以發(fā)揮基因編輯作用。本研究首先通

3、過生物信息學分析得到差異表達基因，構建帶有目標基因的CRISPR/Cas9表達系統(tǒng)，采用PEG介導原生質體的方法，首次將構建的帶有組氨酸激酶基因和GATA轉錄因子的CRISPR/Cas9表達載體共轉入金針菇原生質體，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能，對金針菇中的組氨酸激酶基因和轉錄因子進行敲除，以此來驗證這些基因的功能。主要研究結果如下：
　?。?）通過轉錄組測序，得到了7935個差異表達基因，再通過比較轉錄組學和生物

4、信息學分析，找到與冷誘導和生長發(fā)育相關的差異基因，在原基階段表達量下調的兩個組氨酸激酶基因HK1和HK2和一個GATAZinc finger轉錄因子。
　　（2）利用sgRNA在線設計工具以及sgRNA靶點的設計原則，針對兩個組氨酸激酶基因和一個GATAZinc finger轉錄因子的基因序列，分別設計了一個sgRNA，靶序列分別為 GATGGACAGCGGAAAATTGG、GTACCTGTTCGAATGAATGA和GTGGCCA

5、AGCACTTGGAACA。
　　（3）采用酶切連接法和重疊延伸 PCR的方法，構建了6個表達載體，分別是：pgfvs-Cas9、pHK1-gRNA、pHK2-gRNA、pZf-gRNA、pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA。
　?。?）通過金針菇原生質體單核化，得到了3個單核菌株：D-A、D-C和D-D，通過對單核菌株出菇實驗，得到單核菌株均能出菇，最終確定了轉化所需的單核菌株為：