蛋白質組學篩選肝癌差異蛋白及其與腫瘤分子成像特征的相關研究.pdf

1、目的：本研究擬應用蛋白質組學方法，建立人分辨率高和重復性好的肝癌組織(門靜脈轉移組/門靜脈非轉移組)及正常肝組織的二維電泳圖譜，篩選并鑒定癌組織與正常肝組織以及門靜脈轉移的肝癌組織和門靜脈無轉移的肝癌組織間差異表達蛋白并進行表達水平驗證，并將轉移相關蛋白表達強度與腫瘤分子成像特征進行相關性研究。為最終發(fā)現(xiàn)肝癌診斷、預后生物標志物以及治療靶標提供重要信息。 方法：收集術后新鮮肝癌標本和距癌旁1.5cm以上正常肝組織保存于-80℃?zhèn)?/p>

2、用。根據(jù)病理診斷結果將標本分為3組：門靜脈轉移的肝癌組(肝癌轉移組)、門靜脈未受侵犯的肝癌組(肝癌非轉移組)、正常肝組織組(正常組)，每組各5例。提取組織總蛋白，采用雙向凝膠電泳(2-DE)技術得到各組凝膠圖譜。采用PD-quest 7.3軟件進行合成、對比和差異分析，識別肝癌轉移組、肝癌非轉移組、正常組之間差異表達蛋白斑點；選取差異蛋白質點，膠內酶解后行肽指紋圖分析及網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫鑒定，鑒定差異蛋白質。然后采用免疫印跡(Western B

3、lot)驗證部分差異表達蛋白(annexin A3、 laminB1、HSP27、nm23-H1、Prohibitin、Triosephosphate isomerase(EC5.3.1.1)(TIM))的表達水平。應用免疫組織化學方法進一步在臨床標本中檢測這些蛋白的表達情況，分析其表達水平與腫瘤分子影像特征的相關性。 結果：建立了正常肝組織和肝癌雙相凝膠電泳圖譜，多數(shù)蛋白質點集中在pH4～8、分子量20～100KDa范圍。選擇

4、在肝癌轉移組和肝癌非轉移組中表達均高于正常組的13個點進行質譜分析，并鑒定出在肝癌轉移組中表達高于肝癌非轉移組中表達的7種蛋白質為annexin A3、1aminB1、annexin A1、transgelin-2、TCP1、PRP2、RANBP Protein。 Western Blot檢測肝癌和配對正常肝組織中annexin A3、1amiaB1、HSP27的表達發(fā)現(xiàn)，肝癌中3種蛋白的表達強度均高于正常肝組織中的表達；而抑癌

5、基因表達蛋白nm23-H1、Prohibitin、Triosephosphate isomerase(EC 5.3.1.1)(TIM)在肝癌組織中表達降低。 在以上對篩選蛋白進行初步驗證的基礎上，采用免疫組織化學方法檢測annexin A3和nm23-H1在組織樣本中的表達情況，探討annexin A3和nm23-H1表達水平的病理意義，annexin A3在正常肝組織組(正常組)、肝癌門靜脈未受侵犯組(非轉移組)、肝癌伴門靜脈

6、轉移(轉移組)中的表達陽性率分別為10％，35％，92.5％，方差分析提示多組間比較具有顯著性差異(x 2=57.667，P<0.001)。進一步進行兩組間的比較發(fā)現(xiàn)：annexin A3陽性表達率在正常組分別與非轉移組、轉移組，非轉移組與轉移組組間均有顯著性差異。nm23-H1在正常組、非轉移組、轉移組中的表達陽性率分別為85％，82.5％，15％，方差分析提示多組間比較具有顯著性差異(x 2=52.95，P<0.001)。進一步進行

7、兩組間的比較發(fā)現(xiàn)：正常組和非轉移組間的nM23-H1陽性表達率無顯著性差異(x2=0.092，P=0.762)。正常組與轉移組間，非轉移組與轉移組間的nm23-H1陽性表達率均有顯著性差異(P<0.001)。 進一步探討annexin A3和nm23-H1表達水平與腫瘤分子成像特征的相關性。PET-CT顯示門靜脈主干及分支出現(xiàn)充盈缺損組與非充盈缺損組間annexin A3及nm23-H1均有顯著性差異(P<0.001)，而腫瘤大

8、小、形態(tài)、糖代謝SUV組間annexin A3及nm23-H1均無顯著性差異(P>0.05)。 結論：本研究應用蛋白質組學方法比較人肝正常組織、肝癌門靜脈未受侵犯組、肝癌伴門靜脈轉移間的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)正常組織和肝癌組織間，以及門靜脈轉移和門靜脈非轉移組間均存在蛋白質表達的差異，對部分差異蛋白進行了質譜分析，鑒定了可能參與肝癌發(fā)生和發(fā)展相關蛋白。通過免疫印跡方法驗證結果與蛋白質組學方法結果一致。 應用免疫組織化學方法進