新城疫病毒核酸適配體的篩選研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的一種高度接觸性的烈性傳染病。禽類感染后以呼吸道、消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要特征。該病呈世界性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。核酸適配體是利用SELEX技術(shù)篩選與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA片段，有“化學(xué)抗體”之稱。由于具有免疫原性低、靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、易于化學(xué)合成和改造標(biāo)記等優(yōu)點，核酸適

2、配體在疾病診斷和治療領(lǐng)域中顯現(xiàn)出重要的應(yīng)用價值。
　　本研究，體外合成總長度為81 nt的ssDNA文庫，中間為40 nt的隨機序列，兩端為用于PCR擴增的固定序列。通過優(yōu)化PCR條件制備高純度的dsDNA和ssDNA，實驗確定PCR最佳退火溫度Tm=65 ℃，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為12個循環(huán)，不對稱PCR引物含量比為F:R=100:1，下游引物含量固定為0.5 pmoL，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為40個循環(huán)。篩選以原核表達的HN蛋白和新城疫病毒GM株為

3、靶標(biāo)，利用硝酸纖維素膜過濾方法和微孔板法分離靶標(biāo)-寡核苷酸復(fù)合物，經(jīng)過10輪的反復(fù)篩選，獲得針對HN蛋白和新城疫病毒GM株的富集文庫。最后一輪篩選得到的ssDNA文庫經(jīng)PCR擴增為雙鏈后，進行連接、轉(zhuǎn)化并克隆測序。通過ELISA實驗挑選出親和力和特異性高的適配體，使用 DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行一級結(jié)構(gòu)分析，隨機序列區(qū)（N40）的相似性為61.5％～98.4%，均富含C或T，無保守序列，并利用Mfold預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，主要形成大環(huán)加

4、小環(huán)突起的結(jié)構(gòu)。ELISA和Dot blot實驗分析適配體的親和力和特異性，實驗結(jié)果顯示適配體B53對HN蛋白及新城疫病毒GM株有較高的親和力，并且能夠特異性識別HN蛋白和新城疫病毒GM株，而對禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和SPF尿囊液無反應(yīng)性。適配體血凝抑制試驗結(jié)果表明，針對GM株病毒的優(yōu)勢適配體均具有不同程度的的血凝抑制活性，病毒對照組血凝效價為11log2，A1處理組的血凝效價為9log2，A3處理組的血凝效價為7log2，A20