內(nèi)毒素與TRAM基因表達的關系及TRAM siRNA對內(nèi)毒素炎癥反應的抑制效應研究.pdf

1、膿毒癥休克這一最嚴重的并發(fā)癥是致命性的，死亡率達30-70％。細菌內(nèi)毒素或脂多糖是誘導膿毒癥或失控性炎癥反應的主要因素之一。盡管對內(nèi)毒素導致炎癥反應的分子機制已進行深入研究，但新的作用機制仍在不斷探索。從分子機制上看調(diào)控內(nèi)毒素炎癥反應的靶點很多，而要選擇一個對機體影響相對較少，又能控制炎癥反應發(fā)展成失控性炎癥反應并具有臨床應用前景的靶點卻困難重重。近年來，鑒定的TLR4細胞內(nèi)MyD88非依賴信號轉導途徑在LPS膿毒癥中扮演重要作用，這為

2、尋找內(nèi)毒素膿毒癥治療靶點提供了新思路。TRAM是特異性針對LPS細胞內(nèi)MyD88非依賴信號轉導接頭蛋白，理論上可滿足候選條件。因此，本課題選擇TRAM基因為研究對象，從以下幾方面對內(nèi)毒素與TRAM基因表達的關系及TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應的抑制效應進行初步探討。 其主要研究方法和結論如下：1.利用生物信息學技術的蛋白質(zhì)預測軟件對TRAM蛋白的二級結構和B細胞表位進行了分析和預測，結果顯示其最可能的優(yōu)勢B細胞表位于TRAM

3、分子N-末端第216-229位之間，氨基酸序列為QSIWKETRSVSQKQ。 2.通過人工合成該氨基酸序列，免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗小鼠TRAM蛋白多克隆抗體，并通過ELISA、細胞免疫化學染色及Westernblot檢測證實該多克隆抗體具有較高的特異性免疫原性，為后續(xù)研究準備了實驗工具。 3.設計針對TRAM基因的特異性引物，經(jīng)RT-PCR擴增特異性的TRAM基因cDNA片段，連接至pGEM-T載體，轉化入大腸桿

4、菌DH5a，重組pGME-T載體經(jīng)酶切和測序檢測證實成功。這樣構建了熒光定量PCR檢測TRAM基因mRNA表達的外標準品。 4.采用實時熒光定量PCR(RQ-PCR)技術檢測LPS刺激小鼠RAW264.7細胞對TRAM基因表達mRNA的影響，結果顯示：在小鼠RAW264.7細胞中TRAM基因正常表達mRNA的量相對較低，約為2.51×105拷貝數(shù)；當LPS100ng/ml刺激4h時，TRAM基因mRNA的表達明顯增加；隨著時間延

5、長其表達進一步增加，至LPS刺激12h時，基因表達至高峰，約為3.46×106拷貝數(shù)，比正常細胞基因mRNA的表達增高了一個數(shù)量級，刺激至24h時基因表達有所下降，但仍然顯著高于對照組。Westernblotting和免疫細胞化學染色檢測TRAM蛋白的表達的結果與其mRNA的表達類似，其高峰在12-16h之間。用LPS不同劑量刺激細胞，Westernblot檢測可見高劑量刺激細胞表達TRAM蛋白條帶比低劑量刺激細胞產(chǎn)生蛋白條帶明顯增加。

6、這說明TRAM基因mRNA表達和蛋白表達與LPS刺激有明確的時效和量效關系。 5.根據(jù)siRNA設計原則設計了2條小鼠TRAM基因的特異性靶序列(每條64nt)。構建并鑒定表達TRAMsiRNA的重組質(zhì)粒，重組pSUPER-EGFP質(zhì)粒用于轉錄功能性的TRAMsiRNA。2條靶序列插入pSUPER-EGFP質(zhì)粒H1啟動子的下游。將重組質(zhì)粒轉化進E.coliJM109，最后通過雙酶切和測序重組證實pSUPER-EGFP載體構建成功

7、。 6.R-pSUPER-EGFP采用LipofectamineTM2000轉染入RAW264.7cell。經(jīng)RQ-PCR和Westernblotting檢測轉染細胞(R1C和R2C)TRAM基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達.結果顯示：轉染細胞(R1C和R2C)TRAM基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達被明顯的抑制。 7.EMSA檢測LPS刺激轉染TRAMsiRNA的細胞顯示：野生型RAW264.7細胞的NF-κB活性表達條帶明顯大于

8、轉染重組質(zhì)粒RAW264.7細胞的條帶，提示轉染TRAMsiRNA的細胞能明顯降低NF-κB活性表達。細胞因子檢測結果顯示，TRAMsiRNA既可抑制促炎細胞因子(TNF-α)增高，也可抑制抗炎細胞因子(IL-1Ra)增加，并可抑制INF-β分泌。因此，TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應具有明顯的抑制效應。 本研究課題在細胞水平證實了TRAMsiRNA對內(nèi)毒素炎癥反應具有明顯的抑制效應，顯示siRNA是一種有效的實驗工具，并提示