IFN-γ誘導(dǎo)的犬免疫相關(guān)GTP酶在弓形蟲感染中的作用.pdf

1、弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病原蟲，可引起弓形蟲病。全球約有三分之一的人感染有弓形蟲，我國感染率約為5％-10%。弓形蟲為躲避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用，會(huì)寄生在宿主免疫系統(tǒng)難以覆蓋的器官，例如通過血腦屏障入侵動(dòng)物或人的大腦中引起神經(jīng)癥狀或者記憶衰退；越過血眼屏障引起視力障礙；也能通過血胎屏障導(dǎo)致人和動(dòng)物的流產(chǎn)。目前尚無有效的疫苗預(yù)防該病，因此弓形蟲病嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。
　　弓形蟲在侵入宿主細(xì)胞形成不與宿主細(xì)胞內(nèi)

2、膜系統(tǒng)相融合的納蟲空泡膜，其在保護(hù)弓形蟲體免受宿主細(xì)胞內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的殺傷過程中起著非常重要的作用。另外，有研究表明病原體侵入宿主機(jī)體后會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生包括促炎性細(xì)胞因子和干擾素在內(nèi)的大量天然免疫分子的表達(dá)。炎性細(xì)胞因子可增加血管通透性，提高吞噬細(xì)胞和免疫因子對弓形蟲的殺傷作用。在小鼠中，干擾素可通過作用于細(xì)胞表面受體誘導(dǎo)大量內(nèi)源性天然免疫蛋白的表達(dá)，其中在抵御弓形蟲感染中發(fā)揮主力作用的是免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)和鳥苷酸結(jié)合蛋白(

3、GBPs)，它們能夠在Irgms的“引導(dǎo)”下定位到納蟲空泡膜上，形成類似“攻膜復(fù)合體”的結(jié)構(gòu)，使得弓形蟲納蟲空泡膜發(fā)生囊泡化，進(jìn)而被破壞，迫使其包裹的弓形蟲被釋放并為宿主細(xì)胞內(nèi)的天然分子所消滅和清除。
　　本研究旨在探究犬中的IRGs是否在抵御弓形蟲感染中也發(fā)揮著重要的作用。
　　首先，通過將IRGM4、IRGM5及IRGM6與GST標(biāo)簽蛋白融合進(jìn)行原核表達(dá)，制備出重組蛋白，免疫小鼠分別制備出抗IRGM4、IRGM5以及IR

4、GM6的特異性多克隆抗體以進(jìn)行IRGM4、IRGM5及IRGM6的內(nèi)源性表達(dá)的檢測。
　　然后，設(shè)計(jì)出特異性針對IRGM4、IRGM5及IRGM6的正向和反向gRNA，將其與Cas9同時(shí)轉(zhuǎn)染MDCK中，建立以上三個(gè)基因缺失的細(xì)胞系，并應(yīng)用Western blot方法對基因缺失狀況進(jìn)行驗(yàn)證。
　　最后，通過IRGM4ko、IRGM5ko、IRGM6ko和正常的MDCK細(xì)胞在IFNγ誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下納蟲空泡內(nèi)弓形蟲生長情況的比