阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)醛固酮致心肌成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制探討.pdf

1、目前有關(guān)PTEN和CaN的研究多局限于心肌細(xì)胞肥大中，在心肌纖維化上的研究很少；在他汀類藥物抗心肌纖維化中PTEN和CaN是否參與未見相關(guān)報(bào)道。故本研究以體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，以醛固酮誘導(dǎo)其心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，并加入阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)干預(yù)，觀察在阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)心肌成纖維細(xì)胞增殖的過程中PTEN mRNA和蛋白、CaN mRNA和蛋白的表達(dá)變化，并進(jìn)一步觀察加入FPP、GGP

2、P分別逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀對(duì)Ras和Rho蛋白的作用后上述指標(biāo)的表達(dá)變化，以探討PTEN和CaN是否參與了他汀類藥物抗心肌纖維化的作用，并明確PTEN和CaN在甲羥戊酸途徑中與Rho及Ras蛋白的關(guān)系，從而深入了解他汀類藥物抗心肌纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 第一部分醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)的影響 方法：用胰酶消化法分離并培養(yǎng)新生SD大鼠的心肌成纖維細(xì)胞，以醛固酮誘導(dǎo)其增殖和膠原合成，并加入螺內(nèi)酯(spironola

3、ctone，Spi)干預(yù)，采用MTT檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，羥脯氨酸檢測(cè)其膠原合成，半定量RT-PCR測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞CaN mRNA的表達(dá)，Western blot測(cè)定其CaN蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.醛固酮和螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響：與對(duì)照組比較，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的平均吸光度值均顯著升高(P<0.05)，但三組之間沒有差異性；10-7mol/L Al

4、d+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的平均吸光度值均明顯低于10-7mol/L Ald組(P<0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 2.醛固酮和螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響：與對(duì)照組比較，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的羥脯氨酸含量均顯著升高(P<0.05)，但三組之間沒有差異性；10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mo

5、l/L Spi組的羥脯氨酸含量均明顯低于10-7mol/L Ald組(P<0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 3.醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CaN mRNA表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的CaN mRNA水平明顯升高(P＜0.05)，并呈濃度依賴性，10-7mol/L Ald組的CaN mRNA水平明顯高于10-8mol/L和10-9mol

6、/L Ald組(P＜0.05)。 4 螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CaN mRNA表達(dá)的影響：10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的CaN mRNA水平明顯低于10-7mol/L Ald組(P＜0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 5 醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)的影響：10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的CaN蛋白水

7、平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，并呈濃度依賴性，10-7mol/L Ald組的CaN蛋白水平明顯高于10-8mol/L和10-9mol/L Ald組(P＜0.05)。 6 螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)的影響：10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的CaN蛋白水平明顯低于10-7mol/L Ald組(P＜0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 結(jié)論：

8、外源性醛固酮可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，發(fā)揮其致心肌纖維化作用，此作用與其通過鹽皮質(zhì)激素受體(MR)介導(dǎo)的基因組通路升高CaN mRNA、蛋白水平的表達(dá)有關(guān)。 第二部分醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響 方法：以體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，加入醛固酮和螺內(nèi)酯干預(yù)后，采用MTT檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，羥脯氨酸檢測(cè)其膠原合成，半定量RT-PCR測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)，W

9、estern blot測(cè)定其PTEN蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.醛固酮和螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響：與對(duì)照組比較，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的平均吸光度值均顯著升高(P＜0.05)，但三組之間沒有差異性；10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的平均吸光度值均明顯低于10-7mol/L Ald組(P＜0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩

10、組之間比較也沒有差異性。 2.醛固酮和螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響：與對(duì)照組比較，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的羥脯氨酸含量均顯著升高(P＜0.05)，但三組之間沒有差異性：10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的羥脯氨酸含量均明顯低于10-7mol/L Ald組(P<0.05)，而與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 3

11、.醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)的影響：與對(duì)照組相比，10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的PTEN mRNA水平明顯降低(P<0.05)，并呈濃度依賴性，10-7mol/L Ald組的PTEN mRNA水平明顯低于10-8mol/L和10-9mol/L Ald組(P<0.05)。 4 螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)的影響：10-7mol/L Ald+10-8mol/L

12、、10-9mol/L Spi組的PTEN mRNA水平均明顯高于10-7mol/L Ald組(P<0.05)，但與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 5 醛固酮對(duì)心肌成纖維細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響：10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L Ald組的PTEN蛋白水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，并呈濃度依賴性，10-7mol/L Ald組的PTEN蛋白水平明顯低于10-8mol/L和10-9m

13、ol/L Ald組(P<0.05)。 6 螺內(nèi)酯對(duì)心肌成纖維細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響：10-7mol/L Ald+10-8mol/L、10-9mol/L Spi組的PTEN蛋白水平均明顯高于10-7mol/L Ald組(P<0.05)，但與對(duì)照組比較沒有差異性，兩組之間比較也沒有差異性。 結(jié)論：醛固酮可通過MR介導(dǎo)的基因組通路降低PTEN mRNA、蛋白水平的表達(dá)發(fā)揮其致心肌纖維化作用。 第三部分阿托伐他汀對(duì)醛

14、固酮誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶表達(dá)的影響 方法：用醛固酮誘導(dǎo)新生SD大鼠的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，并加入阿托伐他汀、FPP和GGPP干預(yù)，采用MTT檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，羥脯氨酸檢測(cè)其膠原合成，半定量RT-PCR測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞CaN mRNA的表達(dá)，Western blot測(cè)定其CaN蛋白的表達(dá)變化。 第四部分阿托伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響 方法：用醛固酮誘導(dǎo)新生S

15、D大鼠的心肌成纖維細(xì)胞增殖，并加入阿托伐他汀、FPP和GGPP干預(yù)，采用MTT檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，羥脯氨酸檢測(cè)其膠原合成，半定量RT-PCR測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞PTENmRNA的表達(dá)，Western blot測(cè)定其PTEN蛋白的表達(dá)變化。 第五部分在醛固酮誘導(dǎo)和阿托伐他汀干預(yù)的心肌成纖維細(xì)胞中CaN和PTEN表達(dá)的相關(guān)性分析 方法：用醛固酮誘導(dǎo)新生SD大鼠的心肌成纖維細(xì)胞增殖，并加入阿托伐他汀干預(yù)，半定量RT-PCR

16、測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞CaN和PTEN mRNA的表達(dá)，Western blot測(cè)定其CaN和PTEN蛋白的表達(dá)，運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析處理CaN和PTEN表達(dá)的相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。 總結(jié) 1.外源性醛固酮可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，發(fā)揮其致心肌纖維化作用，與其通過MR介導(dǎo)的基因組通路升高CaN表達(dá)有關(guān)。 2.醛固酮可通過MR介導(dǎo)的基因組通路降低PTEN表達(dá)發(fā)揮其致心肌纖維化作用。