人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶CTL表位多抗原肽(MAP)疫苗的設計及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、[背景和目的]
　　 惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，傳統(tǒng)的手術、放、化療的療效又不盡人意，這種局限決定了生物治療必然要參與腫瘤的綜合治療，而腫瘤疫苗是腫瘤生物治療的重要方法。目前常用的腫瘤疫苗傳遞方式分別以細胞、蛋白質(zhì)、多肽、病毒載體為基礎。樹突細胞(Dendritic cells，DCs)是目前已知的抗原提呈功能最強的免疫細胞，將腫瘤相關抗原(Tumor-asscociated antigen，TAA)負載DC是目前常

2、用的腫瘤免疫治療的方式之一。但目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關抗原大多具有組織特異性，如AFP只針對肝癌等，以這些抗原來進行免疫治療，只能對相應的腫瘤起作用，限制了以這些抗原為靶標的腫瘤疫苗的廣泛應用。尋找腫瘤特異性的共有抗原是腫瘤免疫治療的關鍵問題。
　　 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，又名人端粒酶催化亞單位，為端粒酶活性的限速成分，是癌細胞永生化的必要途徑，在維持腫瘤繼續(xù)分裂、增殖和生存中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外許多研究表明，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在85%以上

3、的惡性腫瘤及其癌前病變中過度表達，其異常表達或激活是腫瘤形成的重要原因之一，新近研究報道人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的高表達也與腫瘤的不良預后、浸潤轉(zhuǎn)移均密切相關。我們過去的研究表明，帶有hTERT全長基因的腺病毒載體負載DC，以及帶有hTERT全長基因和隱性表位的顆粒疫苗，在體內(nèi)外均可以誘導產(chǎn)生hTERT特異性的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)，對hTERT陽性的胃癌、結腸癌等多種癌細胞具有一定的殺傷效應，而對表達hTERT陰性的淋巴細胞和DC不具有

4、殺傷效應。與hTERT全基因序列腺病毒負載DC疫苗相比，多肽疫苗沒有腺病毒載體的參與，不必考慮載體及其整合的安全性，也不必考慮全長蛋白中某些非優(yōu)勢表位或病理表位的毒副作用；而且，抗原肽長度僅8-15個左右的氨基酸序列，體外可以合成，臨床應用前景更廣闊。但多肽疫苗也常有其不足之處：最大的問題在于一個多肽疫苗只能代表一個表位，分子量小，結構單一，免疫原性較弱，在體內(nèi)容易降解。為解決這一弊端，1988年Tam實驗室提出了多抗原肽(Multip

5、le antigen peptides，MAP)的設計方案，其聚賴氨酸核心構成一種十分緊密有序的樹狀結構，它在加強了抗原表位肽鏈結構特異性的同時，還增大其分子質(zhì)量，不僅很好的模擬了天然表位的空間構象，而且還不需要再耦聯(lián)載體蛋白就能誘導較強的免疫反應；同時，其穩(wěn)定的二級結構不易反轉(zhuǎn)，故降解速度減緩，延長抗原刺激時間，獲得更好的殺傷活性。MAP疫苗的設計方案不僅適用于B細胞表位，同樣也適用于T細胞表位。
　　 基于以上分析，本實驗擬

6、選取人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HLA-A2限制性CTL表位hTERT-540(ILAKFLHWL)，hTERT-865(RLVDDFLLV)and hTERT-572Y(YLFFYRKSV)，構建其四分支多抗原肽，研究其在體外體內(nèi)的抗腫瘤活性，并與攜帶hTERT全長基因腺病毒載體疫苗、單肽疫苗誘導的CTL活性進行對比，為hTERT的MAP疫苗抗腫瘤效應的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1、選取三條人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶CT

7、L表位[hTERT-540(ILAKFLHWL)，hTERT-865(RLVDDFLLV)and hTERT-572Y(YLFFYRKSV)]設計其MAP結構，采用標準固相肽合成法(SPSS)合成其四分支肽；反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)
　　 分析其純度；液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)檢測多肽分子量。陰性肽選用人HIV病毒HLA-A2限制性表位(ILLEP VHGV)。
　　 2、按文獻所述分離培養(yǎng)人外周血單個

8、核細胞(PBMC)來源的樹突細胞。采用光學顯微鏡觀察其形態(tài)，并采用流式細胞術鑒定其細胞表型。然后將攜帶hTERT全長序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽、及其對應單肽分別負載DC后，誘導產(chǎn)生人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL。采用標準51Cr釋放實驗檢測人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對不同腫瘤靶細胞[SW480結腸癌細胞(hTERT+，HLA-A2+)、KATO-Ⅲ胃癌細胞(hTERT+，HLA-A2+)、U2OS骨肉瘤細胞(hTERT-

9、，HLA-A2+)，轉(zhuǎn)染了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA的U2OS/hTERT骨肉瘤細胞(hTERT+，HLA-A2+)，MCF-7乳腺癌細胞(hTERT+，HLA-A2+)，HepG2肝癌細胞(hTERT+，HLA-A2-)，轉(zhuǎn)染了HLA-A2 cDNA的HepG2/HLA-A2肝癌細胞(hTERT+，HLA-A2+)的免疫殺傷活性；采取同樣方法檢測上述人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對低表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的自體淋巴細胞和樹突細胞有無殺傷作用

10、以研究其毒副作用；采用ELISPOT試驗檢測產(chǎn)IFN-γ效應細胞的數(shù)量。
　　 3、按文獻所述分離培養(yǎng)C57BL/6-Tg(HLA-A2+)小鼠骨髓來源的樹突細胞(mDC)，
　　 采用光學顯微鏡觀察其形態(tài)，采用流式細胞術鑒定其細胞表型。然后將攜帶hTERT全長序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽、及其對應單肽分別負載mDC后，免疫小鼠，每周一次，共三次。最后一次免疫7天后取免疫小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞，51Cr

11、釋放實驗檢測人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對上述的腫瘤靶細胞以及自體淋巴細胞和樹突狀細胞有無殺傷效應；采用ELISPOT試驗檢測產(chǎn)IFN-γ效應細胞的數(shù)量。
　　 4、實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 1、通過反相高壓液相色譜儀(RP-HPLC)檢測合成的多抗原肽及對應單肽的純度均在95%以上，達到國際多肽實驗標準。液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC

12、/MS)檢測合成的多抗原肽及對應單肽的分子量，結果表明所得肽的分子量理論值與實測值之間無明顯差異，為我們所需的目的多肽。
　　 2、體外(In vitro)和離體(Ex vivo)實驗均提示，攜帶全長hTERT序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性CTL對于人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性且HLA-A2陽性的SW480、MCF-7、KATO-Ⅲ細胞具有明顯的殺傷作用，且攜帶全長hTERT序列的腺病毒載體誘導的殺傷效應最強；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

13、MAP所誘導的殺傷效應明顯高于其對應單肽誘導的殺傷效應；但對HLA-A2陽性但人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陰性的U2OS細胞或人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性但HLA-A2陰性的HepG2細胞均無殺傷效應，對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性且HLA-A2.1匹配的U2OS/hTERT細胞和HepG2/HLA-A2.1細胞，提示該CTL反應具有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶特異性及HLA-A2限制性。同時本實驗還發(fā)現(xiàn)，無論是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽誘導的CTL，還是其對應單肽誘導的效應細

14、胞對低表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的自體淋巴細胞和DC都不具有殺傷效應，提示人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽疫苗的安全性。通過ELISPOT試驗檢測產(chǎn)IFN-γ效應細胞的數(shù)量，結果顯示攜帶全長hTERT序列的腺病毒載體可以誘導效應細胞釋放最多IFN-γ；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽較之其對應單肽可以誘導更多的效應細胞產(chǎn)生IFN-γ。但在去除CD4+T淋巴細胞后，攜帶全長hTERT序列的腺病毒載體、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶MAP肽及其對應單肽誘導效應細胞分泌IFN-