應用Ussing-chamber連續(xù)灌注系統(tǒng)對人眼睫狀體上皮離子轉運機制的研究.pdf

1、青光眼是第二位的不可逆性致盲眼病，因青光眼而致盲的患者數(shù)以百萬計，青光眼給個人、家庭和社會均帶來了沉重的負擔，嚴重影響患者的生存質量和社會生產力的發(fā)展，因此青光眼的防治研究具有其迫切性，并具有顯著的經濟效益及社會效益。青光眼的基本病理機制是眼壓的病理性升高導致視神經乳頭損害和視野的缺損，目前認為青光眼治療是通過各種治療手段降低眼壓、保護患者殘存的視功能，以達到視神經保護的目的。因此降眼壓治療是青光眼最重要的治療手段。房水的生成及排出的動

2、態(tài)平衡是影響眼壓的最重要因素，目前藥物治療是最有效的直接抑制房水生成及/或促進房水排出的降眼壓治療方法，是減緩青光眼致盲的發(fā)生及發(fā)展的重要干預治療手段。正常生理狀態(tài)下房水分泌具有晝夜節(jié)律性，夜晚睡眠狀態(tài)房水分泌明顯減少(50％～60％)，而青光眼患者的房水分泌晝夜特性則恰恰與之相反，夜晚睡眠狀態(tài)房水生成明顯增加，房水生成的晝夜特性與眼壓的調控及青光眼患者視神經、視野損害之間具有極其密切的聯(lián)系，因此對正常人眼睫狀體離子轉運機制的研究及房水

3、分泌機制的研究是很有必要的。實驗動物所得到的結果表明，房水是由睫狀體上皮(ciliaryepithelium，CE)兩層細胞即色素上皮(pigmentedepithelium，PE)和非色素上皮(non-pigmentedepithelium，NPE)細胞組成的合胞體功能單位所分泌，PE細胞面向睫狀體血液側而NPE細胞則面向睫狀體的房水側，兩層細胞與頂膜相連，之間為大量的縫隙連接(gapjunctions，GJ)。在房水分泌的過程中Na

4、+、Cl-的攝取及分泌是關鍵，其中Na+,K+-ATP酶是主動的離子的能源系統(tǒng)。PE細胞可能通過Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運體(cotransporter)或Cl--HCO3-及Na+-H+交換器(exchanger)從血液側攝取Na+及Cl-，再通過可自由交換離子的縫隙連接從PE細胞轉運到NPE細胞，NPE細胞則通過Cl-離子通道或Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運體釋放Na+及Cl-到后房形成房水。由于不同種屬之間房水的成分及離子轉運

5、的機制不同，其房水分泌的機制可能不同，且目前國內外尚未見有對人眼睫狀體上皮合胞體完整功能單位的系統(tǒng)研究，因此很有必要對人眼睫狀體上皮離子轉運特點及其調控機制進行研究，以期闡明人眼睫狀體上皮房水分泌機制與眼壓調控機制之間的關系，為青光眼患者的眼壓調控機制的研究及青光眼治療靶眼壓的確定奠定理論基礎，并為青光眼患者的藥物治療提供有效、毒副作用低微的藥物的開發(fā)提供理論依據。 目的 研究離體人眼睫狀體上皮離子轉運特點及其調控機制，

6、闡明人眼睫狀體房水分泌的機制與眼壓調控機制之間的關系，為青光眼患者眼壓調控機制的研究及青光眼治療靶眼壓的確定奠定理論基礎，并為青光眼患者的藥物治療提供有效、毒副作用低微藥物的研發(fā)提供理論依據。 方法 采用改良的Ussing-chamber連續(xù)灌注系統(tǒng)電生理檢測方法，對新鮮離體的人眼睫狀體上皮進行電參數(shù)的測量，并應用不同離子濃度液體替代、Na+,K+-ATP酶阻滯劑、Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運體抑制劑、Cl-通道阻滯劑

7、及縫隙連接阻滯劑等對睫狀體血液側和/或房水側進行灌注，觀察這些藥物對人眼睫狀體上皮電參數(shù)的影響。 結果 1.73個可用資料標本中房水側電極性為正性者41個，房水側電極性為負性者32個；房水側為正性電位差(potentialdifference，PD)者其PD、短路電流(short-circuitcurrent，SCC)及電阻(resistance，R)分別為：0.56±0.06mV、12.03±1.26μA/cm2及48

8、.0±1.7Ωcm2；房水側為負性PD者其PD、SCC及R分別為：-0.40±0.05mV、-9.83±1.14μA/cm2及46.6±1.7Ωcm2。房水側電極性與標本獲取的時間之間無關聯(lián)。當房水側為負性時，PD及SCC的極性均依賴于灌注液中的Cl-濃度，Cl-濃度下降到60mM時PD及SCC的極性逆轉。 2.所有睫狀體標本均對哇巴因(ouabain)有反應，起作用時間快(1分鐘)。當PD為負性時，先發(fā)生超極化，待達到最大值后

9、則去極化。當PD是正性時，很快發(fā)生超極化，但不再發(fā)生去極化。 3.當PD為正性時，不論布美他尼(bumetanide，BMT)加入到房水側或血液側均能引起明顯的抑制作用，使睫狀體上皮PD及SCC抑制，抑制率在血液側分別為83％及85％，在房水側分別為54％及60％。當PD為負性時，BMT加入到血液側對電參數(shù)無作用，加入到房水側則引起超極化刺激作用。 4.不論PD為正性或負性，尼氟滅酸(niflumicacid，NFA)及

10、苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid，NPPB]均先引起超極化，然后再去極，使PD及SCC被抑制，。4,4'-二硝基二苯乙烯-2，2’-二磺酸鈉(4，4'-dinitrostilbene-2,2'-disulfonicacid，DNDS)在血液側或房水側均對睫狀體電參數(shù)無明顯的影響作用。 5.雙側應用3.5mM的庚醇(heptanol)，當PD為正性時先是小的去極化，然后

11、是明顯的超極化作用；當PD為負性時則先有一小的超極化，然后是同樣幅度的去極化并回復到原有的基線水平。 結論 1.離體人眼睫狀體上皮組織長時間內(4～6小時)可以維持其活性，可以應用于跨睫狀體上皮離子轉運研究。 2.人眼跨睫狀體上皮電位差PD可表現(xiàn)為房水側正性或負性，與睫狀體組織離體的時間無相關性。房水側PD極性依賴于細胞外Cl-的濃度，Cl-可能是人眼睫狀體上皮跨膜電位產生的重要成分。 3.Ouabain

12、可阻斷人眼睫狀體上皮PE及NPE細胞上的Na+，K+-ATP酶，引起跨睫狀體上皮電參數(shù)的改變，Na+，K+-ATP酶在維持睫狀體上皮跨膜電位差起重要作用。當房水側PD為正性時，睫狀體上皮跨上皮的電位差可能由Na+的轉運占主導地位。 4.BMT可明顯抑制人眼睫狀體上皮PD及SCC，且以血液側的抑制作用更大。Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運體可能存在于人眼睫狀體上皮的PE及NPE細胞上，其PE細胞攝取Na+及Cl-的方式可能是，至少大

13、部分是通過Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運體來實現(xiàn)的。 5.DNDS在血液側對人眼睫狀體上皮電參數(shù)無影響，提示Cl--HCO3-交換器可能不是人眼睫狀體上皮PE細胞攝取Cl-的主要方式。 6.heptanol對人眼睫狀體上皮電參數(shù)的影響提示縫隙連接是睫狀體上皮離子轉運的一個重要環(huán)節(jié)。 7.NFA及NPPB對人眼睫狀體上皮電參數(shù)的抑制作用，提示Cl-通道可能存在于人眼睫狀體上皮NPE細胞上，并在睫狀體上皮離子轉運中起