三鄰甲苯磷酸酯對(duì)大鼠精原干細(xì)胞毒性機(jī)制的研究.pdf

1、目的:三鄰甲苯基磷酸酯(TOCP)在工業(yè)中廣泛應(yīng)用,并可導(dǎo)致機(jī)體的生殖毒性,但確切機(jī)制仍不甚完全清楚。本課題通過觀察 TOCP對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠精原干細(xì)胞活性的影響,探究TOCP的雄性生殖毒性作用及其相關(guān)機(jī)理。
　　方法:1、用MTT法檢測(cè)TOCP和LPC對(duì)分離提取的9 d雄性SD乳鼠精原干細(xì)胞活性的影響;2、用流式細(xì)胞儀和RT-PCR檢測(cè)TOCP和LPC對(duì)大鼠精原干細(xì)胞周期的影響;3、用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢

2、測(cè)TOCP和LPC對(duì)大鼠精原干細(xì)胞凋亡的影響;4、用Western blot法檢測(cè)TOCP和LPC對(duì)大鼠精原干細(xì)胞自噬蛋白的影響。
　　結(jié)果:1、分離提取9 d雄性SD乳鼠精原干細(xì)胞,分別用不同濃度的TOCP(0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)作用于大鼠精原干細(xì)胞48 h后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TOCP呈濃度依賴式地抑制大鼠精原干細(xì)胞活性( P﹤0.05

3、)。2、分別用不同濃度的TOCP(0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)作用于大鼠精原干細(xì)胞48 h后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TOCP對(duì)大鼠精原干細(xì)胞周期無明顯影響;RT-PCR法結(jié)果顯示,TOCP對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)周期蛋白P21、P27和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)也無明顯的影響。3、Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示,與對(duì)照組(0 mmol/L TOCP)相比

4、,不同濃度(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1.0 mmol/L)的TOCP處理精原干細(xì)胞48 h后,大鼠精原干細(xì)胞凋亡無明顯影響。4. Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TOCP可使大鼠精原干細(xì)胞中的自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比例明顯增加,并且使自噬蛋白Atg5和Beclin1表達(dá)量也顯著增加。5、RT-PCR結(jié)果顯示,TOCP呈濃度依賴式地抑制大鼠精原干細(xì)胞內(nèi)NTE mRNA的表達(dá)。6、分別用不同濃度的LPC

5、(0μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)作用于大鼠精原干細(xì)胞48 h后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,LPC呈濃度依賴式地抑制大鼠精原干細(xì)胞活性(P﹤0.05)。7、分別用不同濃度的LPC(0μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)作用于大鼠精原干細(xì)胞48 h后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPC對(duì)大鼠精原干細(xì)胞周期無明顯影響;RT-PCR法結(jié)果顯示,

6、LPC對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)周期蛋白P21、P27和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)也無明顯的影響。8、Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示,與對(duì)照組(0μmol/L LPC)相比,用不同濃度LPC(20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)處理精原干細(xì)胞48 h,對(duì)大鼠精原干細(xì)胞凋亡無明顯影響。9、RT-PCR和Western blot法結(jié)果顯示,LPC對(duì)大鼠精原干細(xì)胞內(nèi)NTE蛋白及其mRNA的表達(dá)無明顯影響。10、W

7、estern blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LPC可使大鼠精原干細(xì)胞中的自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比例明顯增加,并且使自噬蛋白Atg5和Beclin1表達(dá)量也顯著增加。
　　結(jié)論:1、TOCP可誘導(dǎo)大鼠精原干細(xì)胞自噬并抑制其活性,但對(duì)大鼠精原干細(xì)胞的周期和凋亡無明顯影響;2、LPC可誘導(dǎo)大鼠精原干細(xì)胞自噬并抑制其活性,但對(duì)大鼠精原干細(xì)胞周期和凋亡無明顯影響;3、TOCP可抑制大鼠精原干細(xì)胞內(nèi)NTE mRNA表達(dá),但LPC對(duì)大鼠精原干