代謝因子對胰島和下丘腦內分泌相關電生理反應的影響.pdf

1、內分泌細胞及神經內分泌細胞是機體內一類主要可興奮性細胞，其生理功能為分泌相關激素或神經遞質。各種類型分泌細胞在接受刺激產生分泌活動前，均表現(xiàn)出膜電位、電阻等一系列電信號的改變。因此，揭示分泌細胞電生理特性的研究對于探討其細胞內分泌調控機制顯得尤為重要。機體內分泌系統(tǒng)和神經內分泌系統(tǒng)受多種代謝因子的調節(jié)，如碳水化合物，氨基酸及脂肪酸以及多種代謝相關因子（如Leptin，Adiponectin，Ghrelin，Obestatin）等。為探討

2、機體代謝相關因子對內分泌及神經內分泌細胞電生理特性和分泌活動的影響，本研究選擇經典內分泌細胞胰腺β細胞為代表，研究了物質代謝中脂肪酸對細胞電生理特性及分泌功能的影響，探討脂肪酸直接影響β細胞的機制；選擇經典生長軸的生長激素細胞，研究了新近發(fā)現(xiàn)的胃腸激素Ghrelin及Obestatin對生長素細胞的上層調控神經內分泌細胞--GHRH神經元的電生理特性及其功能的影響，探討機體代謝因子Ghrlein對生長激素分泌的間接調控的機制。

3、本文共分為三章。在第1章和2章，采用原代培養(yǎng)的大鼠胰腺β細胞，研究了脂肪酸對胰腺β細胞電生理特性的影響及其機制。第3章采用eGFP-GHRH轉基因小鼠，在新鮮制備的下丘腦腦片上檢測Ghrelin及Obestatin對小鼠GHRH細胞在完整神經網(wǎng)絡中突觸反應的影響。 第一章長鏈脂肪酸對大鼠胰腺β細胞上電壓依賴性鉀電流的影響1.采用制霉菌素穿孔的全細胞電流記錄方法，檢測到長鏈脂肪酸可顯著性減小IK電流，并引起此電流的快速失活，另外，

4、時間曲線顯示此效應為可逆性。 2.采用RT-PCR方法檢測到GPR40mRNA在大鼠胰島組織、MIN6小鼠β細胞株和INS-1大鼠β細胞株上均有高水平GPR40mRNA的表達。 3.采用GPR40特異性siRNA下調MIN6細胞GPR40mRNA的表達后，細胞的電壓依賴性鉀電流無明顯改變，但亞油酸誘導的電壓依賴性鉀電流降低效應則被顯著抑制。給予受體后分子信號的激動劑，即膜通透性cAMP的激動劑，8-bromo-cAMP，

5、在正常MIN6細胞和siRNA-GPR40處理后MIN6細胞上，均可觀察到類似亞油酸誘導的鉀電流抑制效應。 4.ELISA檢測結果顯示，亞油酸呈濃度依賴性增加MIN6β細胞株胰島素的分泌。而相同濃度的甲基亞油酸鹽并不影響胰島素分泌及亞油酸的促胰島素分泌效應。 結論：①亞油酸通過與細胞膜上GPR40受體結合，顯著降低大鼠胰腺β細胞上電壓依賴性鉀電流并加快其失活。②亞油酸的快速效應可引起胰腺β細胞內鈣離子濃度增高，胰島素釋放

6、顯著增加。 第二章亞油酸對大鼠胰腺β細胞上電壓依賴性鈣電流的影響1.制霉菌素穿孔全細胞電流記錄法，記錄體外原代培養(yǎng)大鼠胰腺β細胞上VDCC電流，細胞外液中加入亞油酸可逆性引起VDCC電流的顯著降低。 2.與GPR40無結合效應的甲基亞油酸鹽對大鼠胰腺β細胞VDCC電流無任何影響，而在此基礎上，再給予亞油酸，可觀察到同樣的VDCC電流降低。 3.亞油酸降低胰腺β細胞上VDCC電流的信號傳導途徑研究顯示，PKC和PK

7、A阻斷劑的存在并不影響大鼠胰腺β細胞上的VDCC電流以及亞油酸降低鈣電流的效應。Thapsigargin預培養(yǎng)30分鐘，可阻斷亞油酸誘導的細胞膜上VDCC電流的改變。 4.[Ca2+]測定試驗顯示，β細胞內鈣濃度的基礎水平不受Thapsigargin的影響；亞油酸顯著增高[Ca2+]i，而甲基亞油酸并不影響細胞內鈣離子濃度的改變。 5.肪酸與GPR40結合，可激活細胞內PLC-IP3途徑，繼而增加細胞內鈣的釋放。采用PL

8、C阻斷劑U73122可完全阻斷亞油酸降低β細胞VDCC電流的效應，同時，亞油酸在β細胞上引起的一過性[Ca2+]i增高也被完全消除。 結論：亞油酸刺激細胞內鈣釋放，通過鈣誘導的VDCC失活顯著降低大鼠胰腺β細胞上電壓依賴性鈣電流。 第三章Ghrelin和Obestatin對GFP-GHRH轉基因小鼠GHRH神經元Glutamatergic及GABAergic突觸反應的影響1.Ghrelin及obestatin對GHRH神

9、經元eEPSCs的影響，試驗分別檢測了16和19個神經元，結果顯示，1μMGhrelin和Obestatin均不影響GHRH神經元上的eEPSCs。 2.Ghrelin對GHRH神經元eIPSCs的影響，在記錄的49個細胞中，26個細胞（約53.06％）的eIPSCs在Ghrelin處理后，較對照電流明顯降低，余24個神經元對Ghrelin并不敏感。另外，Ghrelin對eIPSCs的降低效應呈劑量依賴性。 3.GHSR

10、-1A特異性拮抗劑BIM28163對eIPSCs無影響，但可完全阻斷Ghrelin對GHRH細胞eIPSCs的抑制效應。 4.Obestatin不影響GHRH神經元的eIPSCs，但可完全阻斷Ghrelin對GHRH細胞eIPSCs的抑制效應。 5.為了排除GHRH神經元本身對Ghrelin不敏感的可能性，也采用了先給予Ghrelin，然后Ghrelin與Obestatin聯(lián)合給藥的方式，在6個記錄的GHRH神經元中，均

11、觀察到Obestatin對Ghrelin的拮抗效應。另外，相同條件下Ghrelin雙次給藥均可引起GHRH神經元上eIPSCs電流降低的結果用以排除受體失活導致假陽性結果的可能性。 6.放射免疫法測定小鼠下丘腦腦片培養(yǎng)液中GHRH含量，Ghrlein對基礎水平GHRH的釋放無影響，但可在28mMKCl協(xié)同作用下刺激GHRH的釋放。 結論：①Ghrelin對GHRH細胞的興奮性神經遞質突觸反應無影響，但顯著降低GHRH細胞

12、對抑制性神經遞質的突觸反應，提示Ghrelin可參與調節(jié)GHRH神經元興奮性的增加；②Obestatin阻斷Ghrelin對GHRH神經元eIPSCs的抑制效應提示Obestatin阻斷Ghrelin促GH分泌的機制發(fā)生在下丘腦水平；③Ghrlein對基礎水平GHRH的釋放無影響，但在KCl協(xié)同作用下刺激GHRH釋放，提示其在GHRH分泌釋放中的調節(jié)作用。 綜上所述，本研究首次闡明了長鏈脂肪酸通過與細胞膜上特異性受體結合，對胰腺