ABD蛋白的表達及對K562,HL60細胞的作用研究.pdf

1、研究背景：慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是發(fā)生于造血干細胞的克隆性惡性腫瘤,1845年Craigie[1]和Bennet[2]在愛丁堡發(fā)現(xiàn)。在1960年，Nowell和Hunger-ford首先在費城發(fā)現(xiàn)CML病人具有獲得性的染色體異常，將這個異常的染色體命名為費城染色體(Philadelphia，Ph[3,4])。1973年，Rowley發(fā)現(xiàn)它是9號和22號染色體長臂間交互易位的結(jié)果，即t

2、(9,22)(q34；ql1)[5]。1983年以后，證實了9號染色體上c-abl與22號染色體上bcr基因交互易位，在22號染色體上形成了BCR—ABL融合基因，編碼BCR—ABL融合蛋白，表達P190，P210，P230融合蛋白，具有很強的酪氨酸激酶活性，可使一系列信號蛋白發(fā)生持續(xù)性的磷酸化，導致白血病的發(fā)生[6]。
　　CML病人經(jīng)歷慢性期、加速期、急變期三個階段，各自的中位數(shù)時間分別為3～4年；6～9個月；3～6個月[7]

3、。目前，CML的治療方法主要有化療、干擾素治療、STi571（甲磺酸伊馬替尼）、干細胞移植等。傳統(tǒng)的化療手段雖能改善癥狀，緩解病情，但不能阻止疾病的轉(zhuǎn)化，不能從根本上消除惡性克??；干擾素治療血液學緩解率70～80％，存活期延長72個月；異基因骨髓移植(allo-BMT)是目前最有希望治愈慢粒的方法，但有30％～35％患者移植后出現(xiàn)與移植物抗宿主病(GVHD)相關(guān)的致命性并發(fā)癥，另外，患者本身的年齡要求以及不到1/3的患者可找到配型相一致

4、的同胞骨髓供者等因素限制了其臨床應(yīng)用；自體骨髓移植(ABMT)相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率較低，不受年齡限制，但缺乏有效的體外骨髓凈化措施以預防殘留白血病細胞導致的復發(fā)。STi571是一種bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶抑制劑，STi571單獨或者聯(lián)合干擾素治療有效的CML患者，血液學緩解率可以達到90％，已經(jīng)肯定能延長CML患者生存期，這為CML的靶向治療開辟了一個新的領(lǐng)域，但是STi571的耐藥性問題至今無法解決。
　　目前，眾多的臨床及

5、實驗研究表明，bcr-abl融合基因及其表達產(chǎn)物bcr-abl融合蛋白是慢性粒細胞性白血病治療上的特異性靶位[8,9]。隨著對bcr-abl癌蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的不斷研究，人們逐漸認識到在不同的結(jié)構(gòu)域水平對該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行干預,同樣也可以抑制bcr-abl蛋白酪氨酸激酶的活性,這也提示人們繼續(xù)探索更好的慢粒的治療方法。ABD(肌動蛋白結(jié)合域，actin binding domain）區(qū)是bcr-abl融合蛋白上C末端的一個結(jié)構(gòu)域[1

6、0]，研究表明,ABD在BCR/ABLPTK介導的白血病生成中起重要作用[11-13]，白血病的發(fā)生依賴于碳末端的ABD存在,ABD變異可以降低體外腫瘤細胞的生存活力[11]，而在體內(nèi)則延遲腫瘤的發(fā)病時間,因此如果能夠有效調(diào)控ABD區(qū)，就有可能控制bcr-abl融合蛋白的轉(zhuǎn)化活性，從而達到治療CML的目的。本實驗通過分子生物學方法得到ABD片斷,進行融合表達,對ABD的功能進行研究,從而為白血病的靶向治療奠定新的分子基礎(chǔ)。
　　實

7、驗目的：體外獲得bcr-abl融合基因的ABD區(qū)結(jié)構(gòu)域,進行原核表達,并將融合表達蛋白作用于白血病細胞系,進一步探討其對白血病的細胞周期和增殖的影響，為探索CML新的藥物作用靶點和新的治療藥物奠定了基礎(chǔ)。實驗方法根據(jù)GenBank中人ABD結(jié)構(gòu)域基因的堿基序列，按照引物設(shè)計原則，針對ABD基因設(shè)計引物。以帶有人類慢性粒細胞白血病bcr-abl基因全長的PGD210質(zhì)粒[14]為模板,應(yīng)用PCR技術(shù)擴增出ABD基因的編碼序列，測序結(jié)果證實

8、與GenBank中完全一致；將ABD基因的插入到融合有PTD（蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域，protein tansductong domain）基因片段的原核表達載體pET32a中，以獲得PTD-ABD融合基因。將構(gòu)建重組原核表達載體pET32a-PTD-ABD轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌BL21后，予以IPTG誘導，改變誘導條件，使目的蛋白PTD-ABD在上清中有較大量表達。大量誘導細菌，用次氮基三乙酸鎳瓊脂糖（Ni-NTAagarose）親和層析珠對

9、可溶性目的蛋白進行純化。將目的蛋白PTD-ABD與K562細胞和Hela,HL60細胞共培養(yǎng)，用免疫熒光和Westernblot的方法觀察和驗證目的蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運情況；用光學顯微鏡和細胞計數(shù)研究細胞形態(tài)和生長曲線的變化；MTT、流式細胞儀技術(shù)研究PTD-ABD融合蛋白對K562細胞和HL60細胞的增殖和凋亡的作用。
　　實驗結(jié)果：ABD結(jié)構(gòu)域基因被有效的擴增，DNA序列分析表明所構(gòu)建的PTD-ABD融合基因的表達質(zhì)粒與預期設(shè)計相同

10、，ABD、PTD、PTD-ABD融合蛋白得到正確的表達。且PTD-ABD目的蛋白成功導入K562細胞和HL60中，能顯著抑制HL60細胞的生長，并且對HL60細胞的增殖具有明顯的抑制作用。
　　實驗討論本研究成功地構(gòu)建了原核表達載體pET32a-PTD-ABD，并順利表達PTD-ABD融合蛋白于上清中。在功能實驗中，研究了目的蛋白對K562,HL60細胞的作用。這一實驗結(jié)果為下一步研究目的蛋白的作用機制，以及為探索CML新的治療藥