尸體心肌組織蛋白質時序性降解代謝組學推斷死亡時間的研究.pdf

1、目的和意義：由于尸體受到自身和周圍各種環(huán)境因素的綜合影響，致使有效的推斷PMI，迄今為止，沒有一種方法被公認精確，故此，探究精確推斷PMI的方法，已成為法醫(yī)學的緊要任務和艱巨挑戰(zhàn)。隨著死后時間的延長，尸體宏觀形態(tài)上，發(fā)生劇烈且持續(xù)性的死后變化，追本溯源，本質在于多因素作用下，自身生化物質的改變，即功能性、結構性大分子生物物質單向性降解，產生游離性小分子物質的過程?；谛呐K為胸腔和心包膜腔內相對獨立的實質內臟器官，心肌組織富含蛋白質、核酸

2、等生物大分子，在本研究中，借助氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(Gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS)，對所檢測的小分子有機物進行快速準確的定性定量分析，通過心肌組織氨基酸類含量時序性變化規(guī)律及其與推斷PMI相關性，探討其準確量化地推斷PMI的可行性。
　　材料與方法：汕頭市屠宰場，成年家豬10頭，體重150kg±20kg，均放血處死，提取全心臟組織（包括心包膜），分別置于恒溫、恒濕的人工智能氣

3、候箱中，模擬自然腐敗，在0h-144h間每隔12h一個時間點，按“六定”標準，規(guī)范化取材，8個樣本/時間點。
　　GC-MS(安捷倫，美國)檢測：心尖近左心室外膜側、避開血管，按時間點取0.1g心肌組織，以80％乙醇溶液（1:10）固定8h，以500μL0.1mol/L鹽酸酸化、勻漿機勻漿，5000r/min離心30分鐘，提取上清液400μL，加入乙腈去蛋白后，提取上清液50μL，加入20μL正亮氨酸，做為內標，混勻吹干。加50μ

4、L的吡啶和50μL MTBSFA，在微波爐中火下衍生化，持續(xù)2分鐘；靜置1h后，取1μL上述樣品，進行上機檢測，利用GC/MS自帶的數(shù)據(jù)分析工作站，進行定性定量分析，識別各氨基酸并導出其參數(shù)，以各氨基酸峰面積與內標（正亮氨酸）峰面積的比值做為系數(shù)，計算各氨基酸相對含量。
　　統(tǒng)計分析
　　簡單線性回歸(Linear Regression，LR)、單因素方差分析Bonferroni法兩兩比較均值、逐步多元線性回歸(Stepwi

5、se Multiple Linear Regression,SMLR)，P<0.05為顯著性差異，推導多種氨基酸推測PMI線性擬合公式，采用SPSS進行。采用Simca-P13.0進行多維統(tǒng)計分析，描繪整體趨勢及代謝輪廓，包括偏最小二乘法(Partial Least Square, PLS)、主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)。用GraphPad Prism5統(tǒng)計圖標軟件制圖。
　　結

6、果：
　　1、80%乙醇與甲醇固定-萃取液對比：30℃60h組檢出氨基酸種類差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05，兩種固定方法的效果相同。
　　2、80%乙醇固定時間：固定8h后，各氨基酸相對含量量與種類基本不再隨固定時間的延長而變化（小幅度上下波動，不影響量級），80%乙醇固定兼萃取時間最好超過8h-72h或以上。
　　3、80%乙醇固定豬心臟組織，GC-MS檢測結果，各溫度組氨基酸相對含量整體上，與PMI呈線性增加趨勢：

7、
　?、?0℃組可識別峰氨基酸含量與PMI的主成分分析(PCA)：模型R2X=0.904，Q2=0.559，所測10種氨基酸120h呈明顯增高線性趨勢，最佳線性“窗口期”為36h-120h，0h-36h增幅不明顯，呈前“平臺期”；120h后，組內離散程度大，但依然呈現(xiàn)增長趨勢，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示20℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI最佳“窗口期”為死后36h-120h之間。PLS分析：R2X=0.802，R2Y=0.96

8、9，Q2=0.962。Y預測圖的回歸曲線方程：Y20℃=0.995689x+0.264853(R2=0.969199)。大部分氨基酸含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)明顯的線性關系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　20℃組各氨基酸綜合多元線性逐步回歸方程：YPMI=14.130+20.259X纈氨酸+26.008X丙氨酸+34.102X甘氨酸+25.946X谷氨酸+101.903X甲硫氨酸(R2=0.980，P<0.005，模

9、型F=320.690， SE=5.3978)。
　　⑵25℃組可識別峰氨基酸含量與PMI的主成分分析(PCA)：R2X=0.897，Q2=0.756，大部分氨基酸從24h開始，隨著PMI延長，增長趨勢明顯，總體“窗口期”比20℃組前移12h，“窗口期”為24-120h，0-24h呈前“平臺期”，120h后，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示25℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI的最佳“窗口期”為死后24h-120h之間。PLS分析:R2

10、X=0.862，R2Y=0.951，Q2=0.940。Y預測圖的回歸曲線方程：Y25℃=0.998566x+0.682288(R2=0.951206)。大部分氨基酸的含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)較為明顯的線性關系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　各氨基酸綜合多元線性逐步回歸分析方程：YPMI=31.092+11.982X亮氨酸+57.449X甲硫氨酸+21.895X甘氨酸(R2=0.963，P<0.005，模型F=168

11、.204，SE=7.397)。
　　⑶30℃組氨基酸與PMI的主成分分析(PCA)：R2X=0.904，Q2=0.769，總體“窗口期”比25℃組前移12h，“窗口期”為0-120h，不出現(xiàn)明顯的前平臺期，120h后，相對前階段波動性較大，但依然呈現(xiàn)增長趨勢，未出現(xiàn)明顯的“后平臺期”，提示30℃環(huán)境溫度下，心肌組織推斷PMI的最佳“窗口期”為死后12h-120h之間。PLS分析:R2X=0.895，R2Y=0.978，Q2=0.9

12、15。Y預測圖的回歸曲線方程：Y30℃=1x+6.27635e-006(R2=0.977632)。大部分氨基酸的含量隨PMI延長而增多，呈現(xiàn)較為明顯的線性關系，回歸方程分別為：此處為圖表省略...
　　各氨基酸綜合多元線性逐步回歸分析方程:YPMI=1.209+8.504X谷氨酸+10.640X絡氨酸(R2=0.984，P<0.005，模型F=474.793，SE=5.71475)。
　?、纫怨絍=(132h氨基酸含量-0

13、h氨基酸含量)/132計算氨基酸平均生成速率V20℃、V25℃、V30℃，其中V25℃:V20℃≈2～2.5:1, V30℃:V20℃≈3～5:1，即30℃組的生成速度為20℃組的3到5倍，符合范特霍夫規(guī)則(Van't Hoff's rule, or the rule of ten) K(T+10k)/K(T)≈2～4，即溫度每升高10℃/k，化學反應速率增加2～4倍，提示尸體心肌組織蛋白質降解為其最小結構性功能分子氨基酸的生成速率與環(huán)

14、境溫度存在符合范特霍夫規(guī)則的規(guī)律性。
　　結論：
　　1、利用GC-MS檢測80%酒精作為固定液兼萃取液的心臟組織氨基酸相對含量，呈明顯的時序性增高變化規(guī)律，推斷PMI“窗口期”為死后120h，預測誤差5～8h左右，具有較好的應用前景。
　　2、環(huán)境溫度溫度作為影響推斷PMI的重要因素，可明顯加快死后心肌組織降解生成生成氨基酸的速率，V30℃:V20℃≈3～5:1，提示尸體心肌組織蛋白質降解最小結構性功能分子氨基酸的生