同種異體骨移植中骨形成相關因子表達趨勢研究.pdf

1、同種骨材料具有豐富的來源，且因其具有天然結構、形狀和強度，有一定的誘導活性，在骨移植中有其不可替代的地位。冷凍、凍干和脫鈣同種骨均已應用于臨床，包括骨腔充填、骨段移植術、關節(jié)融合術和假體重建術等諸多方面。例如脫鈣骨，經(jīng)化學滅菌、提取抗原和自溶消化處理后，其可溶性同種抗原得到消除，植入受體后，新骨形成遠較運用新鮮骨、凍干全骨或Co 60輻照滅菌的凍干骨時為多。 在骨移植后的骨折愈合過程中，包括了骨祖細胞的趨化、增殖、分化以及合成細

2、胞外基質的多個組織學進程。自細胞、血管以及骨基質的損傷開始，最終至徹底重新塑形且無瘢痕形成，新骨形成是相關細胞和細胞外基質相互作用的連續(xù)變化過程。通過多年的研究，目前，骨折愈合的組織學過程和特征已得到明確闡述，但分子水平的調控機制方面仍有待進一步明確。國內外研究者采用免疫組織化學、逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，RT-PCR)、原位雜交等方法，檢測了骨形

3、成相關發(fā)生蛋白-2(BoneMorphogenetic Protein-2，BMP-2)及血管內皮生長因子(Vascular EndothelialGrowm Factor，VEGF)、腫瘤生長因子-β(Tumor Growth Facto-β，TGF-β)在骨折愈合過程中的內源性表達，考核了多種因子在骨折愈合中的誘導成骨作用，表明上述骨形成因子是骨折愈合過程中的關鍵物質。對于骨折區(qū)域的新生骨發(fā)育相關細胞，多種生長因子可以促進其增殖、分

4、化以及細胞外基質合成，對骨折修復的啟動、發(fā)展、調控及改建起重要作用。鑒于此，應用生長因子促進骨折愈合可能取得良好的療效，研究者們也開展了廣泛的基礎研究，在此基礎上的一系列動物實驗和臨床應用結果也表明，生長因子類物質用于骨折延遲連接或骨不連的治療確有良好效果。雖然骨折愈合的分子調控中有許多生長因子參與，但目前只對少數(shù)幾種的作用機制有所了解，其中研究較為透徹的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)家

5、族、TGF-β以及VEGF等。上述幾種骨形成相關因子由炎癥細胞、成骨細胞和軟骨細胞合成，在骨折愈合全過程持續(xù)表達，因此對于骨愈合的進程以及骨移植的效果評價具有客觀性。本研究主要對同種異體骨移植及自體骨移植后的愈合過程中BMP-2、VEGF及TGF-β的表達情況進行定量考察及變化趨勢分析，以選擇可能存在的合適的術后時間段，保證以上三種生長因子的分泌表達都處于上升期甚至達到峰值，為術后干預提供參考。在以往的研究中，人們多是對單一運用的細胞因

6、子與骨修復的關系進行評價和考核，結果確切，但卻未曾考慮到多種因子可能存在強烈的協(xié)同或拮抗作用。為了使試驗接近機體內部的真實進程，我們對三種因子的表達情況、變化趨勢同時進行考核，并且探討之間可能的相互關系，為多因子聯(lián)合應用于骨修復的臨床方案提供可能的理論依據(jù)。此外，本研究還對同種異體骨和自體骨移植相同時間區(qū)段內的內源性相關生長因子表達進行比較，從分泌生長因子的角度評判同種異體骨和自體骨移植的區(qū)別，為選擇更能促進骨再生的骨移植材料來源提供佐

7、證。盡管在骨移植后，機體的骨形成機理已經(jīng)得到較完整的闡述，但本研究考察的多種因子的持續(xù)表達也是一個動態(tài)的變化和非直觀化的過程，其評價難以簡單地量化。 應用光鏡進行觀察屬于較簡單和直接的方式，但是只能起到定性的判斷，而且其判斷受操作者的主觀因素、觀察區(qū)域及實驗儀器的客觀因素的影響較大，難以進行標準化和規(guī)范化。而免疫組織化學染色、放射骨顯影定量評價、生物力學分析以及RT-PCR等手段的應用，可以達到較精細程度的考量，為移植骨區(qū)域骨再

8、生的量化評判提供了多種選擇： (1)免疫組織化學染色：上世紀90年放代以來，金巖和張子軍等人利用免疫組織化學方法，對骨折區(qū)域的BMP-2表達進行了定量和定位研究，發(fā)現(xiàn)了BMP-2的分泌表達存在一定的時間依賴性，得到了其變化趨勢，同時還證實了骨缺損區(qū)存在的BMP-2濃度梯度，為BMP-2的表達研究奠定了基礎。近年來，還有人應用原位雜交技術證明了BMP-2的mRNA表達規(guī)律與蛋白的表達相一致，提示BMP-2表達情況的研究將會為開發(fā)

9、內源性BMP-2在臨床中的應用提供廣闊的前景。 (2)放射骨顯影定量評價：骨骼的主要無機鹽成份是羥基磷灰石晶體，其結構類似離子交換柱，具有很大表面積，通過化學吸附和離子交換從血液中獲取磷酸鹽和其它元素來完成代謝更新。骨移植后，待軟組織損傷反應減退，局部骨顯像若見移植骨處放射性近似或高于正常骨組織，表明血運良好，植骨成活。 (3)生物力學分析：通過抗扭強度等參數(shù)的分析，術后生成新骨的質量也可以得到較好的監(jiān)控。(4)RT

10、-PCR方法：有研究表明，術后3～4周開始，促進骨修復的生長因子開始從效應細胞以旁分泌等多種形式出胞表達，并持續(xù)至術后第12～14周，骨修復進入骨性連接形成期，生長因子的內源性表達出現(xiàn)負反饋調控，而術后第16周后，內源性骨修復相關生長因子的表達量與正常情況相比，沒有顯著差異。因此，本研究選擇了術后第4周～12周，采用了RT-PCR的方法，對同種異體骨移植和自體骨移植后的相關生長因子的表達進行考核，通過對生成的cDNA量進行灰度分析，并與

11、統(tǒng)一的內對照指標進行比較，得到各細胞因子的相對豐度，在此基礎上進行統(tǒng)計學分析，分析骨形成相關因子的變化趨勢與可能的相互作用關系。本研究主要分為三個部分： 第一部分： 本部分研究的目的主要是制備同種異體骨和自體骨移植的動物模型，為下一步提取骨痂總RNA奠定基礎。以成年雄性新西蘭大白兔為實驗動物，隨機分為同種異體骨移植組(30只)、自體骨移植組(30只)及取材組(10只)。然后將同種異體骨移植組和自體骨移植組，根據(jù)取材時間點

12、(術后第4、6、8、10、12周)分別再分為5組。從取材組橈骨處制備植入物，經(jīng)處理后，手術植入同種異體骨移植組橈骨處；從身體對側橈骨處制備植入物，經(jīng)處理后，手術植入另一側肢體前臂橈骨處。術后第4、6、8、10、12周，從手術處新生成骨痂分離取材，以備RNA提取。 通過對同種異體骨和自體骨移植的動物模型的制備及取材，為下一步進行RNA提取提供了實驗對象。 第二部分： 本部分研究以移植兔橈骨為研究對象，分別于同種異體

13、骨和自體骨植入后4、6、8、10和12周取各組節(jié)段骨痂，提取總：RNA，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測BMP-2、TGF-β和VEGF的mRNA表達。試驗結果表明，通過萃取，成功獲得各種因子的總RNA，經(jīng)過紫外分光光度計定量，RNA產(chǎn)物的純度和濃度均較高。甲醛變性電泳結果顯示，各RNA條帶亮度高，28S、18S、5S條帶均較清晰，且28s條帶的亮度與18s條帶的比值均接近2倍，表明提取的總RNA基本沒有降解，有較好的完整性

14、。經(jīng)過兩步法擴增，BMP、VEGF、TGF-β的DNA片段大小分別為250bp、420bp和500bp，β-actin為300bp DNA片段，均與預期結果吻合。本部分研究在成功抽提總RNA的基礎上，設計引物，分別擴增得到各生長因子的cDNA，與預期片段大小一致，為統(tǒng)計學分析提供了可靠的原始數(shù)據(jù)。 第三部分： 通過對上部分結果進行統(tǒng)計學處理和分析，利用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，考核骨形成相關因子BMP-2、TGF-β和

15、VEGF的mRNA表達與骨移植后骨形成的時間-效應關系，并比較自體骨移植與同種異體骨在三種骨形成相關因子表達上的區(qū)別。 本研究的結論如下： 一、同種異體骨和自體骨移植后骨組織內存在BMP2、TGF-β和VEGF的持續(xù)分泌表達，其表達趨勢呈現(xiàn)先上升后下降的特點，且均能在術后第8周達到峰值，提示在該時間點附近進行術后干預，可能會取得良好的效果。 二、比較同種異體骨和自體骨移植兩個組別，多種骨形成相關因子的表達呈現(xiàn)出不

16、同的時間、組別敏感性：組別及時間兩個因素對于VEGF的表達不存在交互效應，F(xiàn)=2.226，P=0.079>0.05，進一步地，VEGF的表達在兩個組之間沒有顯著差異，F(xiàn)=0.002，P=0.965>0.05；組別及時間兩個因素對于BMP-2的表達不存在交互效應，F(xiàn)=2.341，P=0.068>0.05，而BMP-2的表達在兩個組之間有顯著差異，F(xiàn)=10.340，P=0.002<0.05；TGF-β的表達受到時間變化及組別的影響，且存在交