機械應力影響鼠骨髓基質細胞OPG-RANKLmRNA表達變化的研究.pdf

1、骨吸收刺激因素包括機械刺激、細胞因子和生長因子刺激等.目前普遍認為,骨吸收刺激因素對前體破骨細胞的誘導功能并不是直接作用于破骨細胞本身,而是通過作用于骨髓基質細胞,引起骨髓基質細胞表型改變,產生旁分泌作用于鄰近的單核前體破骨細胞,使其進一步分化、融合成多核破骨細胞.骨髓基質細胞與前體破骨細胞的作用是體內破骨細胞形成、分化的必需條件.其中,骨髓基質細胞合成、分泌的兩種因子在促進破骨細胞生成過程中起著關鍵性的作用,轉錄因子NF-κB受體活化

2、劑配體(receptor activator of NF-KBligand,RANKL)和另一種由成骨細胞及骨髓基質細胞分泌的可溶性細胞因子骨保護素(Osteoprotegerin OPG).RANKL又稱破骨細胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF),是一種調節(jié)骨代謝的重要因子,主要表達在成骨細胞、骨髓基質細胞以及胸腺、淋巴結和脾組織中.RANKL能夠促進破骨細胞的分化、成熟和活化[1,2

3、].RANKL與破骨細胞前體上的腫瘤壞死因子超家族成員破骨細胞分化因子受體(ReceptorActivator of Nuclear Factor-κB RANK)膜蛋白結合,從而促進破骨細胞前體的分化和成熟[3]而骨保護素(Osteoprotegerin OPG)能與RANKL競爭性結合RANK,阻止RANKL與RANK的結合.由此可見骨髓基質細胞在破骨細胞分化中的重要作用[4]. 機械應變是調控RANKL和OPG合成和分泌變

4、化的一種重要的刺激因素.骨髓基質細胞是一種力學可興奮細胞,體外實驗已經(jīng)證明,一定范圍的機械力可以影響骨髓基質細胞的RANKL和OPG的表達,且表達的量與機械刺激的大小、頻率、作用時間緊密相聯(lián).機械張力在250-2000μe是可為骨組織的維持提供有效的生理性的刺激.當張力超過2500 με時,雖然仍可刺激刺激骨形成,但是在這樣的病理性負荷的作用下骨組織的破壞速度亦大大加快[5]. 研究目的: 1.本實驗通過一種先進的體外細

5、胞拉伸加力裝置,對鼠骨髓基質原代細胞施加生理性及周期牽張力,觀察細胞受力前后細胞形態(tài)及增殖活性的變化. 2.對鼠骨髓基質原代細胞分別施加生理性周期性牽張力,觀察RANKL.和OPG基因的表達變化. 材料和方法: 1.體外細胞加力裝置及力學刺激細胞加力采用華中電子科技大學研制的四點彎曲細胞力學加載儀.該裝置的原理是對彈性塑料板加力使之彎曲,從而使貼壁生長于板上的細胞受到相應的機械牽張力.將大鼠原代骨髓細胞接種到特制

6、的塑料培養(yǎng)板上,繼續(xù)培養(yǎng)24h,培養(yǎng)板上的細胞生長到80﹪匯合,將培養(yǎng)板放入加力皿內,在加力裝置上進行加力.細胞所受的張力大小由彈性板的彎曲位移(mm)表示,位移越大,形變越大,表示細胞受牽張力越大.本研究加力頻率為0.5Hz,位移為1.0mm,即張力為1785p的生理性應力. 2.原代骨髓基質細胞取材骨髓取自清潔級重120g左右雄性SD大鼠.頸椎脫臼法處死2只大鼠,將其完全浸沒于75﹪酒精中,5分鐘后取出置于無菌冰浴手術臺上.

7、分離并取出大鼠后肢雙側股骨和脛骨,去凈附著的肌纖維,在超凈臺內剪去兩端骨骺,用10ml針筒吸取完全培養(yǎng)基(含80﹪α-MEM,20﹪胎牛血清,100U/ml肝素),以不同方向沖洗骨髓腔共4次.細胞吹打均勻后接種于直徑60mm的塑料培養(yǎng)皿,在37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng).整個過程要求嚴格無菌、操作迅速.半小時后吸取細胞混懸液,按1×10<'6>/ml接種至細胞培養(yǎng)瓶中.每隔兩天換液,逐步換去其它參雜的懸浮細胞.一般7-9天

8、后細胞鋪滿底壁,以0.25﹪胰酶消化傳代,反復傳代法純化鼠骨髓基質細胞,細胞傳至第三代時備用. 3.細胞加力 將接近融合的第三代骨髓基質細胞按1×10<'8>/ml的密度接種在2x5cm<'2>的塑料培養(yǎng)板上,分成六組.24h后細胞接近匯合時將細胞培養(yǎng)板置入四點彎曲細胞加力裝置中.設置位移為1mm,頻率為0.5 hz的機械張應力.6組的加力時間分別為O h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h.整個加力過程在無菌的加

9、力皿中進行,加力裝置放置在細胞培養(yǎng)箱中. 4.RT-PCR檢測機械力刺激下細胞RANKL、OPGmRNA的量的變化細胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對數(shù)生長期時,加力位移1.0 mm,頻率0.5Hz、加力時間12 h.加力過程中,分別在Oh、1h、3h、6h、9h、12h這6個時間點收集加力后的細胞進行檢測.各組平行重復3次,數(shù)據(jù)結果統(tǒng)計分析. 結果: 1.原代鼠骨髓基質細胞:生長緩慢,大約培養(yǎng)7～9天后,細胞逐漸融合.

10、細胞形態(tài)為紡錘形或成纖維樣細胞,單核,核圓形或卵圓形,有集落樣生長趨勢.原代骨髓基質細胞經(jīng)多次傳代,混雜的血細胞減少,細胞類型趨向一致,排列更有序,呈現(xiàn)更活躍的增殖活動. 2.RANKLmRAN隨加力時間變化統(tǒng)計結果:顯示自6h開始RANKLmRNA開始減少(34.4﹪),但6 h、9 h、12 h之間沒有顯著差異.OPGmRAN隨加力時間變化統(tǒng)計結果顯示自9 h開始OPGmRAN開始增加(73﹪),但9 h、12 h之間沒有顯