棉鈴蟲糖基轉移酶家族基因的克隆及特征分析.pdf

1、鞘糖脂（GSLs）在諸如細胞識別、細胞分化和細胞發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，同時它還是很多細菌毒素的受體，例如霍亂弧菌、痢疾桿菌。糖基轉移酶是GSLs合成的催化酶，相關糖基轉移酶基因（bre）的變異已經(jīng)在線蟲中被證實與Bt抗性有關。在昆蟲中，糖基轉移酶具有很大的類群，相關功能及變異的發(fā)生具有很大的不確定性，它不僅是鞘糖脂合成的催化酶，同時可能在鈣粘蛋白（CAD）、氨肽酶N（APN）、堿性磷酸酯酶（ALP）和糖蛋白的修飾過程中發(fā)揮作用，所以

2、糖基化變異可能不僅僅針只對一種 Bt毒素受體，可能會同時影響幾種重要的結合受體。本研究綜合運用分子生物學技術和生物信息學技術，首次克隆獲得Harmbre2-4 ORF全長序列并初步研究了棉鈴蟲糖基轉移酶基因Harmbre2-5的功能，主要研究內(nèi)容及結果如下：
　　1、利用RT-PCR及RACE技術克隆獲得了棉鈴蟲糖基轉移酶基因Harmbre2-4的ORF全長序列并提交 GenBank。預測 Harmbre2(GenBank KR3

3、62875)、Harmbre3(GenBank KR362876)和Harmbre4(GenBank KR362877)的ORF全長序列長度分別為1011bp、1377bp和1275bp；分別編碼336、458和424個氨基酸；分子量分別為38、52和48kDa；等電點分別為8.75、8.62和8.90。氨基酸序列分析顯示 HarmBre2-4中只有 HarmBre4有信號肽序列。HarmBre2沒有跨膜區(qū)，而HarmBre3和Harm

4、Bre4分別有5個和1個跨膜區(qū)；每個氨基酸序列中都包含對該類糖基轉移酶的催化起重要作用的保守序列。HarmBre3和家蠶（Bombyx mori）的 Bre3（GenBank NP_001243979.1）的相似度高達86％，和小菜蛾（ Plutella xylostella）的 Bre3（ GenBank ADB79796.1）的相似度達到83%。HarmBre2和HarmBre4也和鱗翅目其他害蟲的該類基因氨基酸序列具有很高的相似度

5、。
　　2、運用 qPCR分析了 Harmbre2-5在棉鈴蟲體內(nèi)的時空表達譜。結果顯示在棉鈴蟲不同發(fā)育階段中，Harmbre2、Harmbre3和Harmbre5在卵中表達量較高，Harmbre3和Harmbre4在成蟲階段表達量也較高，Harmbre2-5在棉鈴蟲幼蟲階段和蛹期的表達量相對較低，而且在不同的幼蟲階段和蛹期的表達量沒有顯著性差異。通過分析Harmbre2-5在棉鈴蟲4齡幼蟲不同組織中的表達水平差異顯示：這四個基因

6、在棉鈴蟲腸中的表達量都較低，尤其是在中腸中。Harmbre2在馬氏管中表達量較高；而在其他組織中表達量都比較低，且它們之間沒有顯著性差異。Harmbre3在頭部和圍食膜中表達量較高；Harmbre4在馬氏管中表達量較高；Harmbre5也相類似，在圍食膜和馬氏管中表達量較高。
　　3、通過細胞水平實驗對 Harmbre2、3和5的功能進行研究。結果顯示 Harmbre2、Harmbre3和 Harmbre5表達的蛋白均定位在高爾基

7、體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞質的細胞器內(nèi)，而在細胞核內(nèi)沒有分布。
　　4、通過RNAi技術干擾Harmbre2-5基因的表達，利用qPCR技術檢測沉默效率。結果顯示注射靶標基因的 siRNA后，Harmbre2的基因表達水平下降30%左右，Harmbre3-5的基因表達水平下降50%左右。
　　5、通過RT-PCR技術和實時熒光定量PCR技術分析Harmbre2-5在棉鈴蟲抗感品系間的基因結構和基因表達水平差異。結果顯示 Harmbre

8、3-5在棉鈴蟲 LF系列抗感品系間的基因結構和表達水平?jīng)]有差異，Harmbre2在棉鈴蟲 LF系列低抗品系里的表達量顯著高于敏感品系，而且其基因結構的5′UTR區(qū)，抗性品系與敏感品系相比缺失幾個堿基，5′UTR區(qū)有轉錄調(diào)控基因表達的功能，推測這種差異可能與棉鈴蟲Bt抗性有關。
　　以上結果表明，棉鈴蟲bre基因在卵和成蟲階段高表達，在幼蟲階段和蛹期表達量較低，這表明 Harmbre可能與棉鈴蟲的生育力和進化有關；同時在馬氏管、圍食

9、膜和頭部表達量較高，而在腸中尤其是中腸中表達量很低，表明 Harmbre可能在棉鈴蟲的細胞生長發(fā)育、信號轉導等功能方面發(fā)揮重要作用。細胞水平實驗表明糖基轉移酶主要分布在核膜、內(nèi)質網(wǎng)等細胞質部位?？垢衅废挡町惙治霭l(fā)現(xiàn)Harmbre2在低抗棉鈴蟲體內(nèi)的表達量較高，且在抗性品系中，其基因的5′UTR區(qū)也存在幾個堿基的變異，推測 Harmbre2的表達上調(diào)或者基因突變可能引起棉鈴蟲對Cry1Ac的低水平抗性。本研究對棉鈴蟲糖基轉移酶基因的功能做