骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫性血小板減少癥發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、課題1:間充質(zhì)干細(xì)胞在慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥的作用研究
　　背景:原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一類由于自身免疫導(dǎo)致的血小板破壞增加、血小板生成受損的疾病。由于自身免疫耐受的打破，從而導(dǎo)致針對(duì)血小板以及巨核細(xì)胞的體液免疫和細(xì)胞免疫是慢性ITP的主要發(fā)病機(jī)制。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類能夠在自身免疫耐受中發(fā)揮免疫

2、調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群體，在多種自身免疫性疾病中有報(bào)道骨髓(BM)-MSCs的異常生物學(xué)特征和免疫學(xué)特性。
　　目的:本研究旨在比較研究慢性ITP患者BM-MSCs和正常對(duì)照BM-MSCs生物學(xué)特性及功能的差異，為探討慢性1TP患者BM-MSCs是否存在異常提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)，亦為慢性ITP的發(fā)病機(jī)制研究探討新思路。
　　方法:(1)采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法從慢性ITP患者和正常人骨髓組織中獲取相對(duì)純化的MSCs，除了采用普通

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)外，還設(shè)立了添加bFGF、EGF和ITS這三種額外添加物(addition supplements，AS);(2)倒置顯微鏡觀察BM-MSCs的形態(tài)特征;(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)的BM-MSCs表面標(biāo)志;(4)定向誘導(dǎo)BM-MSCs向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，進(jìn)行相應(yīng)染色，比較成脂、成骨的分化潛能;(5)測(cè)定BM-MSCs增殖能力并繪制生長(zhǎng)曲線;(6)流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)BM-MSCs細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡;(7)建立BM-MSCs與

4、外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)共培養(yǎng)體系，比較研究BM-MSCs對(duì)PHA活化的PBMCs細(xì)胞的增殖、分泌TNF-α、IFN-γ和IL-10的影響;(8)建立BM-MSCs與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，研究BM-MSCs對(duì)CD4+T細(xì)胞向CD4+CD25+CD1271ow調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化的能力。
　　結(jié)果:(1)成功培養(yǎng)并獲取高純度的慢性ITP患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;(2)采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，慢性ITP患者BM-MSCs與正常BM-

5、MSCs存在形態(tài)學(xué)差異，正常BM-MSCs細(xì)胞體積小、纖細(xì)、呈長(zhǎng)梭形，規(guī)則排列生長(zhǎng);ITP患者BM-MSCs細(xì)胞扁平且體積較大，呈短梭形、多角形、不規(guī)則形，邊緣不整齊。AS能夠改善ITP患者BM-MSCs形態(tài)異常，與正常BM-MSCs無(wú)明顯差別。(3) ITP患者BM-MSCs與正常對(duì)照BM-MSCs均表達(dá)CD73、CD105和CD90，均不表達(dá)造血細(xì)
　　胞標(biāo)志CD34、CD45，不表達(dá)CD11b、CD14和CD19。(4) I

6、TP患者BM-MSCs分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞能力與正常BM-MSCs相比未見(jiàn)明顯差異。(5) ITP患者BM-MSCs細(xì)胞凋亡水平明顯高于正常對(duì)照。AS處理能夠減少BM-MSCs的凋亡水平，此時(shí)ITP患者同正常對(duì)照無(wú)明顯差異。(7) ITP患者BM-MSCs以劑量依賴的方式抑制正常來(lái)源PBMCs增殖，但與正常BM-MSCs相比能力下降。ITP患者BM-MSCs抑制PBMCs對(duì)IFN-γ、 TNF-α的分泌，但是促進(jìn)PBMCs分泌IL-

7、10的能力相比正常BM-MSCs下降。(8) ITP患者BM-MSCs誘導(dǎo)正常來(lái)源CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)reg的能力與正常BM-MSCs相比降低。
　　結(jié)論:慢性ITP患者來(lái)源的BM-MSCs增殖能力受損，形態(tài)異常以及過(guò)度凋亡，而這些缺陷可以被改良的培養(yǎng)條件矯正。慢性ITP患者BM-MSCs與正常來(lái)源的BM-MSCs相比有著相同的免疫表型和相似的分化成骨成脂能力。然而慢性ITP患者來(lái)源的BM-MSCs的免疫抑制功能和誘導(dǎo)Tregs

8、的能力相比正常來(lái)源的BM-MSCs明顯下降。這些研究發(fā)現(xiàn)提示了慢性ITP患者BM-MSCs存在一定缺陷，可能與慢性ITP的發(fā)病相關(guān)。
　　課題二:白細(xì)胞介素-7在慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥中的作用研究
　　背景:原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種器官特異性的自身免疫性疾病，伴隨多種免疫異常，包括自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡抵抗。白介素7(Interl

9、eukin-7，IL-7)是由非骨髓來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，能夠維持靜息CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一類重要細(xì)胞因子，在T細(xì)胞清除時(shí)血漿以及組織中的IL-7水平會(huì)明顯升高。而且IL-7也能夠維持未成熟B細(xì)胞的存活并在免疫球蛋白的產(chǎn)生中具有重要作用。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)主要目的是想確定IL-7對(duì)ITP患者外周單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)和骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bo

10、ne marrow mononuclear cells，BMNCs)的作用。
　　方法:(1)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血漿及細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá);(2)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+細(xì)胞表面IL-7α的表達(dá);(3)通過(guò)BrdU摻入的方法檢測(cè)IL-7對(duì)PBMCs和BMNCs細(xì)胞增殖的作用;(4)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-7對(duì)血小板、PBMCs和BMNCs的凋亡影響。
　　結(jié)果:通過(guò)ELISA檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血血漿I

11、L-7水平低于正常對(duì)照，與是否用藥無(wú)關(guān)，與患者血小板水平正相關(guān);疾病緩解后IL-7表達(dá)升高但仍然低于正常對(duì)照。骨髓血漿中IL-7在ITP與患者之間并沒(méi)有明顯區(qū)別。ITP患者和正常對(duì)照CD4+T細(xì)胞表面IL-7Rα表達(dá)水平?jīng)]有差異。體外刺激實(shí)驗(yàn)顯示IL-7上調(diào)了ITP患者自體血小板的凋亡，促進(jìn)外周以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了IFN-γ TNF-α和IL-10的分泌，抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:ITP患者體內(nèi)IL-7