CRISPR-Cas9介導(dǎo)的大豆基因組定點(diǎn)編輯研究.pdf

1、大豆（Glycine max(L.) Merr.）是一種具有極大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的豆科作物，也是人類食物中植物蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。隨著全世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)，大豆的需求量也日益增加，開(kāi)發(fā)用于大豆遺傳改良的新技術(shù)對(duì)于研究大豆基因功能、培育新品種等具有重要意義。近年來(lái)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功在多種重要作物中實(shí)現(xiàn)了基因編輯，但是在大豆中的應(yīng)用并不成熟。本研究中，我們成功構(gòu)建了大豆的CRISPR/Cas9定點(diǎn)敲除體系并檢測(cè)了該技術(shù)對(duì)內(nèi)源基因及外

2、源導(dǎo)入基因的編輯效率，隨后探索了CRISPR/Cas9在大豆中介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入及片段替換的可行性。本研究取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1、以擬南芥的FEI1、FEI2和SHR基因的蛋白序列為基礎(chǔ)序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與大豆的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，與之同源性最高的基因分別命名為GmFEI1、GmFEI2和GmSHR。本研究中成功克隆到了這三個(gè)基因，并用作基因編輯的靶基因。
　　2、本研究中描述了一種在大豆中快速、高特異性的檢測(cè)CR

3、ISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)敲除效率的方法。為了簡(jiǎn)化操作和提高轉(zhuǎn)化效率，我們將sgRNA和Cas9的表達(dá)盒組裝在同一個(gè)載體上，Cas9依據(jù)雙子葉植物密碼子偏好做了密碼子優(yōu)化。該CRISPR/Cas9載體構(gòu)造簡(jiǎn)單，選中靶基因和相應(yīng)靶點(diǎn)后，只需要替換sgRNA的序列即可。載體上還帶有一個(gè)GFP選擇標(biāo)記，可以可視化地快速選擇出轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根。
　　3、本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)sgRNA靶向外源導(dǎo)入基因bar和六個(gè)sgRNA分別靶向兩

4、個(gè)大豆內(nèi)源基因GmFEI2、GmSHR的不同位點(diǎn)，結(jié)合大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)大豆基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)靶點(diǎn)的突變效率。檢測(cè)的170個(gè)發(fā)狀根中有54％在靶點(diǎn)處發(fā)生了定點(diǎn)編輯，Indel頻率為0.6%~95.0%。其中利用PCR/RE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)bar-SP1、GmFEI2-SP1、GmFEI2-SP2和GmSHR-SP3靶點(diǎn)的突變率分別為36.7%、60.0%、93.3%和35.7%，Indel頻率分別為1.3%~21.0%、0.6

5、%~18.8%、1.0%~95.0%和2.8%~28.7%。利用 T7EI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在 GmSHR-SP1和GmSHR-SP2靶點(diǎn)的突變率分別為50.0%和45.4%，Indel頻率分別為2.3%~21.3%和8.7%~30.0%。隨后測(cè)序均發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)處有堿基的插入、缺失及錯(cuò)配突變。結(jié)果證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在大豆中實(shí)現(xiàn)對(duì)外源導(dǎo)入基因及內(nèi)源基因的定點(diǎn)敲除。
　　4、本研究還檢測(cè)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)只使用一個(gè)定

6、制的sgRNA同時(shí)編輯兩個(gè)大豆內(nèi)源基因的潛力。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的GmFEI2-SP3可以同時(shí)靶向GmFEI1和GmFEI2的第三個(gè)外顯子。利用PCR/RE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30個(gè)陽(yáng)性發(fā)狀根中，有三個(gè)在GmFEI1和GmFEI2的靶位點(diǎn)處同時(shí)產(chǎn)生了突變，但是Indel的頻率并不相同，在GmFEI1靶點(diǎn)的Indel頻率分別是32.7%、20.3%和21.6%，而在GmFEI2靶點(diǎn)的Indel頻率分別是7.0%、5.4%和27.0%。未切開(kāi)條帶亞克隆測(cè)序