減毒沙門氏菌介導的t-PA基因表達及生物學活性研究.pdf

1、沙門氏菌是一種侵襲性胞內(nèi)菌，可作為活載體攜帶原核表達質粒和真核表達質粒，并能有效呈遞抗原，激發(fā)抗沙門氏菌和誘導外源蛋白的特異性體液與細胞免疫反應，并能同時誘導粘膜免疫與全身免疫。減毒沙門菌是異源抗原的優(yōu)良載體，具有良好的侵襲力，能很好地定位于免疫組織器官中，被廣泛用于 DNA疫苗新型細菌載體的研究。沙門氏菌自身具有纖溶酶原激活活性，這種活性與其侵染性有一定的關系。組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen ac

2、tivator，t-PA)是血管內(nèi)皮細胞分泌的、具有特異激活血栓纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶，能夠特異地激活血栓纖維上結合的纖溶酶原轉變成具有活性的纖溶酶，對于促纖溶活性引起體內(nèi)彌漫性出血的風險性小。本研究利用減毒沙門氏菌細胞內(nèi)侵襲特性和口服給藥及腸壁吸收的優(yōu)勢，構建攜帶 t-PA基因的重組減毒沙門氏菌，探討減毒沙門氏菌作為活載體用于表達功能基因和預防心腦血管栓塞性疾病及其康復期治療生物制劑的可行性。
　　本實驗根據(jù)人 t-PA的編碼序

3、列設計3對引物，分別擴增 t-PA目的基因片段，構建原核表達質粒 pET28-tPA和 PYA3494-tPA及真核表達質粒 pcDNA3-tPA。將重組質粒 pET28-tPA和 pcDNA3-tPA分別經(jīng)電轉化導入減毒沙門氏菌ΔcrpSL1344，重組質粒 PYA3493-tPA電轉化減毒沙門氏菌ΔcrpΔasdSL1344，構建重組菌?crpSL1344(pET28-tPA)、?crpSL1344(pcDNA3-tPA)和?crp

4、?asd SL1344(PYA3493-tPA)。重組菌分別轉染體外培養(yǎng)的 BHK細胞，SDS-PAGE檢測 t-PA表達情況，ELISA檢測表達水平，纖維蛋白平板溶圈法檢測纖溶活性；在此基礎上，重組菌分別感染昆明白小鼠，Sysmex CA-50血凝儀檢測凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)和纖維蛋白原(FIB)。實驗結果顯示，重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)、ΔcrpS

5、L1344(pET28-tPA)和ΔcrpSL1344(pcDNA3-tPA)在BHK細胞中均有66kDa的蛋白表達，SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測證明表達的目的蛋白為t-PA；轉染96h的表達量分別為197μg/L、118μg/L和135μg/L，轉染重組菌ΔcrpΔasd SL1344(PYA3493-tPA)的細胞裂解液和轉染表達質粒的細胞培養(yǎng)上清均有促進溶解纖維蛋白的活性，轉染真核重組菌ΔcrpSL1

6、344(pcDNA3-tPA)較原核重組菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)的蛋白活性高，且以重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)的活性最高。在凝血四項的檢測中發(fā)現(xiàn)，4組實驗組與對照組相比小鼠的PT、APTT、TT都有不同程度的延長；其中，轉染重組菌ΔcrpΔasdSL1344(PYA3493-tPA)組小鼠 PT、APTT、TT延長極顯著(P<0.01)，F(xiàn)IB的含量降低極顯著(P<0.01)。研究表明