共載神經酰胺—多西他賽脂質納米混懸劑協(xié)同抗腫瘤研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康最嚴重的疾病之一，居發(fā)展中國家致死率首位，抗癌形勢嚴峻。由于腫瘤發(fā)生機制的復雜性和治療的困難性，聯合用藥應運而生并成為當前臨床癌癥治療中最重要的手段之一。聯合用藥能夠發(fā)揮藥物治療協(xié)同作用、提高腫瘤治療效果并降低毒副作用。在聯合用藥中，選擇兩種或兩種以上具有協(xié)同作用的藥物是治療成功的關鍵。將生物活性分子與化療藥物聯用可在不增加毒副作用的基礎上提高藥物療效，在聯合抗腫瘤中顯示出巨大發(fā)展?jié)摿皯们熬啊?br>　　在眾多

2、生物活性分子中，神經酰胺（Ceramide，CE）作為一種新型生物活性分子引起廣泛關注。CE是人體自身存在的一類鞘磷脂，能介導細胞的生長、分化、凋亡等一系列生理活動，同時能夠提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，具有良好的聯合抗腫瘤應用潛力。然而，目前尚沒有CE與抗腫瘤藥物協(xié)同作用的系統(tǒng)性研究，因此，基于CE的聯合抗腫瘤方法具有巨大的研究意義和應用前景。
　　本課題旨在探索基于CE的聯合抗腫瘤方案，確定CE與臨床常用抗腫瘤藥物多西他賽(

3、Docetaxel，DTX)聯用產生協(xié)同作用的機制;開發(fā)一種共遞送CE和DTX的新型“twoinone”脂質納米混懸劑(Lipidbasednanosuspension，LNS)體系，提高CE和DTX溶解度以及二者共遞送效率，協(xié)同提高CE和DTX的抗腫瘤作用，利于未來癌癥的治療。研究內容與結果如下:
　　1.基于神經酰胺的聯合抗腫瘤方案篩選
　　為更大程度上探索CE與化療藥物聯用的潛力，本部分通過噻唑蘭比色法(4，5-Dim

4、ethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)首次系統(tǒng)考察了CE與臨床上廣泛應用的三種化療藥物:DTX、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和多柔比星(Doxorubicin，DOX)聯用后在四種常見腫瘤細胞:黑色素瘤細胞(B16)、卵巢癌細胞(SKOV3)、乳腺癌細胞(MCF-7)和肝癌細胞(HepG2)中的細胞毒性;通過聯用指數(CombinationIndex，CI)

5、法評價聯用藥物間的協(xié)同性，篩選出與CE聯用的最佳化療藥物并對聯用方案進行優(yōu)化。實驗結果表明，聯合用藥組與單獨給藥組相比，能顯著性提高藥物的細胞毒性(p＜0.01);CE與DTX在B16和MCF-7細胞上的聯用指數最低(B16:CI=0.47;MCF-7:CI=0.71)，具有最強協(xié)同作用;聯用比例對藥物間協(xié)同作用影響較大，當CE與DTX以摩爾比例0.5∶1給藥時可獲得最低CI值(B16:CI=0.31;MCF-7:CI=0.48);給藥

6、順序對協(xié)同作用無明顯影響，適合同時給藥。綜上，當CE和DTX以摩爾比0.5∶1同時給藥時，在B16和MCF-7細胞上可獲得最強協(xié)同效果，為最佳聯用方案。
　　2.神經酰胺-多西他賽協(xié)同抗腫瘤機制研究
　　CE和DTX協(xié)同機制尚無任何報道，為更好的驗證CE聯用DTX(CE+DTX)的協(xié)同作用，為CE+DTX聯用方案提供科學的理論基礎，本部分分別從細胞凋亡，Caspase-3活性的激活，細胞周期阻滯和細胞骨架破壞四個方面探索CE

7、和DTX產生協(xié)同殺傷腫瘤細胞的作用機制。在機制闡明基礎上，通過小鼠黑色素瘤(B16)荷瘤小鼠考察CE+DTX體內藥效，評價其體內協(xié)同抗腫瘤效果。實驗結果表明，CE可靶向破壞細胞骨架中的微絲結構，促進微絲聚合和Caspase-3釋放;DTX則可靶向破壞細胞骨架中的微管結構，促進微管聚合并抑制解聚;與單獨用藥組相比，CE+DTX可協(xié)同性破壞整體細胞骨架，最終使細胞凋亡比例、有絲分裂中G2/M期細胞比例均顯著性升高(p＜0.01)。該發(fā)現為C

8、E和DTX的聯用提供了良好的理論基礎，有利于對CE+DTX進行深入研究。體內藥效實驗發(fā)現，CE+DTX組腫瘤抑瘤率高達64.92±0.22％，顯著性高于CE組腫瘤抑瘤率（7.07±3.07％，p＜0.01）和DTX組腫瘤抑瘤率（46.14±4.27％，p＜0.01），表明CE+DTX共同給藥在荷瘤小鼠體內具有良好協(xié)同抑瘤效果，為CE+DTX聯合應用奠定了理論和實驗基礎。
　　3.神經酰胺-多西他賽脂質納米混懸劑藥物含量測定方法建立

9、
　　采用高效液相色譜法(HPLC)測定共載CE和DTX的脂質納米混懸劑(CE+DTX-LNS)中DTX的含量，并對方法學進行研究。結果表明HPLC法簡便快速、靈敏度高、專屬性強，能準確測定DTX含量。
　　采用熒光分光光度法測定4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑(NBD)熒光標記的CE+DTX-LNS中NBD-CE的含量，并對方法學進行研究。結果表明熒光分光光度法靈敏度極高、選擇性好、操作簡便能準確測定CE含量。

10、
　　4.神經酰胺-多西他賽脂質納米混懸劑協(xié)同抗腫瘤研究
　　CE和DTX水溶性均較差，嚴重限制了其體內應用。CE尚無上市制劑，而目前上市的DTX劑型如多帕菲(R)和泰索帝(R)，含有Tween-80和乙醇等助溶劑易導致超敏反應、腎毒性等不良作用。因此本課題采用高壓均質法制備安全無毒的CE+DTX-LNS，采用冷凍干燥技術制備CE+DTX-LNS凍干制劑;透射電鏡觀察粒子外觀形態(tài)，激光粒度分布與電勢分析儀考察其粒徑和電位;動

11、態(tài)膜透析法考察體外釋藥行為;MTT法和Caspase-3活性檢測法考察CE+DTX-LNS體外協(xié)同殺傷腫瘤細胞作用;小動物活體成像技術考察CE+DTX-LNS的體內分布;熒光倒置顯微鏡和流式分析儀評價課題制備的“twoinone”LNS體系(CE+DTX-LNS)在共遞送CE和DTX至同一腫瘤細胞中的優(yōu)勢;通過B16荷瘤小鼠驗證體內協(xié)同抗腫瘤療效，并考察協(xié)同抗腫瘤作用與共遞送效率之間關系。
　　實驗結果發(fā)現，通過最佳處方和制備工藝

12、制得的CE+DTX-LNS形態(tài)呈規(guī)則圓形，粒徑為108.1±3.42nm，電位為-23.25±0.49mV，平均載藥量為11.32±0.11％;制成凍干制劑后穩(wěn)定性得到大幅提升，可在4℃條件下穩(wěn)定儲存3個月;CE+DTX-LNS具有良好緩釋功能，且CE和DTX的釋放相互獨立;與CE(或DTX)溶液組相比，CE-LNS（或DTX-LNS）的細胞毒性顯著增強(p＜0.01)，說明LNS能顯著提高CE或DTX的遞送效率;CE+DTX-LNS體

13、外激活Caspase-3活性能力顯著強于CE-LNS(p＜0.01)和DTX-LNS(p＜0.01)，證明其具有協(xié)同誘導細胞凋亡能力;體外共遞送實驗中，CE+DTX-LNS能夠將CE和DTX高效遞送至同一腫瘤細胞，CE、DTX和細胞共定位良好，而經CE-LNS和DTX-LNS的物理混合物(CE-LNS+DTX-LNS)處理后，細胞分群現象明顯，說明CE和DTX共遞送效率差;CE+DTX-LNS與CE-LNS+DTX-LNS的細胞攝取均呈

14、時間依賴性，其中CE+DTX-LNS最高攝取率為72.6±4.2％，顯著高于CE-LNS+DTX-LNS的64.5±2.7％(p＜0.05)，說明“twoinone”LNS體系中CE能夠促進載體與細胞膜相互作用，增強載體攝取能力;小動物活體成像實驗表明，CE+DTX-LNS與溶液組相比能夠有效延長體內循環(huán)時間并被動靶向遞送至腫瘤組織，減少正常組織分布;體內藥效實驗中，CE+DTX-LNS抑瘤率高達93.94±2.77％，顯著高于單獨給藥

15、的CE-LNS（33.22±5.43％，p＜0.01）和DTX-LNS（69.32±3.65％，p＜0.01）以及市售多帕菲(R)（59.91±4.54％，p＜0.01），證明了CE+DTX-LNS體內良好的協(xié)同抑瘤效果;同時顯著高于CE-LNS+DTX-LNS抑瘤率（84.94±3.76％，p＜0.05），說明CE和DTX共遞送至同一腫瘤細胞是發(fā)揮該協(xié)同抗腫瘤作用的基礎。
　　綜上所述，本研究首次系統(tǒng)考察了CE與不同抗腫瘤藥物的