成年小鼠坐骨神經雪旺細胞體外培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 臨床上導致周圍神經缺損的原因很多，如腫瘤切除、創(chuàng)傷等均可造成神經缺損。臨床上治療周圍神經離斷除及時的神經對位縫合外，一般常用自體神經移植來治療，但是存在造成供區(qū)神經功能喪失、遺留手術疤痕及供體有限、供區(qū)的附加切口、移植神經支配區(qū)的功能障礙等問題，且并不能保證達到確實的修復效果。近年來，周圍神經組織工程技術的興起，為神經缺損的修復提供了新的方法和手段。
　　 從生物學觀點看，周圍神經再生是一個相當復

2、雜的過程，受到多種因素的影響。周圍神經再生過程中，再生軸突的生長、定向和成熟受到周圍神經再生微環(huán)境中各種因素的影響，其中有細胞、細胞外基質和彌散因子等，在再生早期尚有變性的軸突和髓鞘碎屑，其中細胞成份有SC、成纖維細胞、肥大細胞和巨噬細胞等。
　　 周圍神經損傷后，其遠側端由于失去了與神經元胞體的聯(lián)系，遠側端神經纖維的全長發(fā)生華勒氏變性，在光鏡下可見軸突腫脹、外形不規(guī)則、斷裂和溶解等變化。近側端由于與神經元胞體的連續(xù)性存在，根據(jù)

3、不同程度的創(chuàng)傷而出現(xiàn)一個或幾個郎飛結的變性改變。周圍神經再生過程中，近側端軸突的再生和向遠側端的長入，是神經再生的必要條件，也是神經再生的首要因素，而SC恰恰是周圍神經再生微環(huán)中的最重要因素。
　　 SC是PNS特有的膠質細胞，具有增生、遷移和分泌多種活性物質等一系列特有的生物學特性，是周圍神經纖維唯一的支持細胞。SC具有顯著的功能多樣性，在周圍神經再生微環(huán)境中，SC通過與軸突之間的聯(lián)系來調節(jié)髓鞘化、髓鞘形成，且SC參與周圍神經

4、干細胞外基質的形成.周圍神經損傷后，SC發(fā)生反應性增殖，與血源性巨噬細胞一起清除潰變產物，產生及分泌某些物質影響神經的再生，SC在周圍神經系統(tǒng)中促進軸突再生具有重要作用。因此，國內外的學者越來越重視對SC與軸突再生關系的研究。
　　 目前，大多數(shù)研究多關注于周圍神經損傷后遠側端神經再生微環(huán)境的變化。周圍神經損傷后，其遠側端中斷了與神經元胞體的聯(lián)系，遠側端神經纖維的全長直至其終末都發(fā)生潰變，稱為華勒氏變性，包括軸突和髓鞘的變性.留

5、下原先包繞著軸突的基底膜管，SC在基底膜管內分裂、增殖，形成Bunger帶，同時伴有巨噬細胞的浸潤、神經內膜膠原產物的沉積等一系列變化。所有的這些變化都與SC有著廣泛的聯(lián)系。所以，SC是構成周圍神經再生微環(huán)境的主要成份，是促進再生軸突生長的關鍵因素，一旦在神經再生微環(huán)境內缺少SC，軸突或不能生長，或再生速度大大下降。因此，對周圍神經再生微環(huán)境的研究多集中于SC，周圍神經損傷后，SC的數(shù)量、形態(tài)學和生物學特性的變化直接影響神經再生的微環(huán)境

6、。李奕對成年大鼠周圍神經損傷后遠側端SC的變化進行了體外研究，結果表明，周圍神經損傷后，SC形態(tài)發(fā)生改變，1月最明顯;細胞活力和增殖能力也發(fā)生改變，1周活力和增殖能力最強，隨后逐漸變弱。目前，對于周圍神經損傷后近側端變化的研究較少，特別是沒有關于周圍神經損傷后近側端SC的數(shù)量、形態(tài)學和生物學特性變化的研究的報道。我們認為，在周圍神經再生過程中，近側端軸突的再生和向遠側端的長入，是神經再生的必要條件，也是神經再生的首要因素，而SC恰恰是周

7、圍神經再生微環(huán)中的最重要因素。
　　 雪旺細胞在周圍神經組織工程修復中充當種子細胞，是構建組織工程化神經的關鍵。因此快速獲得組織工程化人工神經所需要的SC非常重要。目前國內外在此方面有較多的研究，但是SC是一種終末期細胞，直接取材行雪旺細胞培養(yǎng)，細胞很難貼壁，擴增差，很難得到高純度及大量的SC，所以普遍存在著技術復雜、所需試劑昂貴、SC純度不高等不足，限制了人工神經在臨床上的應用。國內外許多學者研究將干細胞向類雪旺細胞誘導來解決

8、此難題，但誘導率低、誘導條件撤離后再次向干細胞形態(tài)轉歸及致瘤性等缺點，仍限制了其進一步的應用。
　　 在積極探索改進雪旺細胞的體外培養(yǎng)條件，尋找一種較好的獲取雪旺細胞的方法，以獲得足夠數(shù)量的較純凈的雪旺細胞的實踐中，人們發(fā)現(xiàn)，神經預變性不失為一種好的方法，而本實驗探索的新的體外預變性方法具有獨特的優(yōu)越性。神經預變性的目的是創(chuàng)造一個有利于神經再生的微環(huán)境，雪旺細胞的大量增殖是完成這個目的的必要條件。
　　 目前研究表明SC

9、在生長發(fā)育的不同階段及損傷修復過程中表達不同的標記，表明SC并不是一個功能結構同質體，在不同階段有不同的增值生長能力。神經損傷的瓦勒變性過程中，SC發(fā)生去分化變化，表達神經營養(yǎng)因子、細胞粘附分子及不成熟SC標記膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、p75NTR的上調，而這些變化有利于細胞的增值及粘附，促進神經的再生，可能有利于SC的體外貼壁培養(yǎng)、擴增，從而獲得大量的SC滿足人工神經的需要。1999年Keilhoff等通過體內預變性（瓦勒變性）一

10、周后體外再培養(yǎng)獲得了大量的增殖能力強的SCs，證實通過預變性再行細胞培養(yǎng)可以獲得大量的增殖能力強的SC。2009年，Tomita等進行了體內預變性的研究，他們通過觀察預變性后雪旺細胞的遷移情況來評價預變性效果，發(fā)現(xiàn)2周后雪旺細胞遷移最多。體內預變性可以提供大量的增殖能力強的雪旺細胞，有令人興奮的臨床應用前景。但體內預變性需要兩次手術，花費的時間較長，延誤了治療時機，同時由于存在個體差異預變性達到所需效果的時間點難以控制，臨床應用受到一定

11、的限制。因此我們的研究中將成年小鼠的坐骨神經取出放在體外培養(yǎng)液中預先培養(yǎng)一段時間即體外預變性模擬體內的發(fā)生情況，可以避免體內方法的不足。2010年Armin kram等報道了體外預變性，他將坐骨神經置于DMEM+10％FBS進行預變性，結果預變性一周后細胞培養(yǎng)，獲得了大量高純度的SCs。
　　 體內預變性是一個復雜的過程，是多種細胞及因子參與的結果，因此體外預變性要達到體內的效果必須模擬體內環(huán)境。本實驗中，我們加入了雪旺細胞生長

12、所需要的生長因子（forskolin、heregulin-β-1、堿性成纖維細胞生長因子）以期模擬體內實驗的效果。
　　 方法:
　　 1.實驗動物:綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠。c57小鼠，雌雄不限。
　　 2.體外預變性:小鼠頸椎脫臼處死，分離切取坐骨神經，放于含有DMEM、DMEM+10％FBS、SCCM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，1周后待檢。體內預變性:小鼠10％戊巴比妥腹腔注射麻醉，暴露右側坐骨神經，在遠離脊神經

13、根部切斷坐骨神經，并使斷端游離。術后1、2、3周取材待檢。
　　 3.細胞培養(yǎng)及冰凍切片制作:分別將不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)的及新鮮的坐骨神經組織漂洗，切碎，消化酶溶解，接種培養(yǎng)，傳代。48小時后對SCCM組細胞進行純化并做冰凍切片。
　　 4.組織和細胞免疫熒光檢測:取各組的冰凍切片及培養(yǎng)的原代細胞行兔抗S100β及p75NTR免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡觀察組織切片中綠色熒光蛋白及S100β表達情況，普通熒光顯微鏡下觀察細

14、胞染色情況，隨機選取5個視野計算細胞純度。
　　 5.激光共聚焦下觀察拍照。
　　 6.統(tǒng)計學處理:所有計數(shù)值以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間均數(shù)比較單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較方差齊性下采用LSD方法，方差不齊時采用Dunnett T3方法。P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.GFP小鼠組中，體外預變性1

15、周后坐骨神經組織切片綠色熒光表達最強，p75熒光表達最強，說明體外預變性的最佳時間是一周;
　　 2.GFP小鼠組中，SCCM組中1、2、3周綠色熒光表達和p75熒光表達最強。SCCM組與DMEM組和DMEM+10％FBS組及對照組雪旺細胞數(shù)、細胞純度和細胞密度均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 3.C57小鼠組中，對于SCCM培養(yǎng)液中預先培養(yǎng)的坐骨神經獲取的細胞S100β蛋白的免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的雙極或三

16、極樣細胞均為陽性，隨機選取三個視野計算純度為98％。SCCM組與DMEM+10％FBS組和對照組比較，雪旺細胞數(shù)和細胞密度均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。各組原代細胞培養(yǎng)48小時后，雪旺細胞純度，DMEM+10％FBS、SCCM中分別為82.83±3.43％，89.67±3.14％。結論:
　　 1.坐骨神經體外預變性后再行細胞培養(yǎng)簡單，高效，是一種很好的體外培養(yǎng)成年小鼠雪旺細胞的方法。
　　 2.預變性一周后雪旺細胞