尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑對宮頸腺癌細(xì)胞株hela的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、1.研究背景和目的：
　　 在全球范圍，宮頸癌每年新發(fā)病例50萬，死亡約20萬人;在我國每年新發(fā)病例超過13萬（占全球四分之一），死亡約20萬人，死亡率居婦科惡性腫瘤的首位。研究已經(jīng)明確，宮頸癌的主要致病原因是人乳頭瘤病毒((Humanpapilloma virus，HPV)感染。其中宮頸腺癌占10-34％，雖然所占比例較少，但是近年來呈上升及年輕化趨勢[1-2]。宮頸腺癌起源于宮頸管內(nèi)膜，常向內(nèi)浸潤生長，缺乏明顯臨床癥狀，轉(zhuǎn)移

2、出現(xiàn)較早，預(yù)后較差，以手術(shù)、放療、化療為主的綜合治療難以取得滿意的療效。順鉑被認(rèn)為是宮頸癌最有效的化療藥物，被舉薦用于復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移宮頸癌的一線化療，但腫瘤細(xì)胞容易對其產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療無效。基于宮頸腺癌生物學(xué)及治療的反應(yīng)異于宮頸鱗癌，因此，尋求新的宮頸腺癌治療方法和藥物顯得非常重要。
　　 腫瘤分子靶向治療是一種全新的生物治療模式，在腫瘤靶向治療中其特異性最高。其針對細(xì)胞癌變、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的環(huán)節(jié)，從分子水平阻斷腫瘤

3、惡性生物學(xué)行為，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，甚至使腫瘤消退。近年來隨著腫瘤分子靶向治療地快速發(fā)展，分子靶向治療藥物層出不窮，為復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)移的卵巢癌治療展現(xiàn)了廣闊的治療前景。目前宮頸癌的靶向治療藥物研究主要有以下幾類:①表皮生長因子受體抑制劑:一是EGFR單克隆抗體，二是小分子酪氨酸激酶抑制劑;②抗血管生成抑制劑;③多靶點酶抑制劑;④mTOR通路抑制劑。
　　 表皮生長因子受體(epidermal growth factor rec

4、eptor，EGFR)，是一種跨膜糖蛋白。表皮生長因子受體（EGFR/HER）家族由四個糖蛋白組成，包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER-2)、ErbB3(HER-3)、ErbB4(HER-4)。EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。EGFR主要的信號通路有3條:①有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途徑。②

5、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)途徑。③c-Src途徑。通過以上3條主要途徑，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、粘附、遷移和分化的功能[3]。EGFR穩(wěn)定表達(dá)于多種上皮組織、間質(zhì)和神經(jīng)源性組織。研究表明，其在宮頸癌[4]等上皮源性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展、血管生成、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散、凋亡受抑、放化療抵抗密切相關(guān)。EGFR已成為腫瘤治療的重要靶點[5-7]。EGFR抑制劑主要有兩類:一是EGF

6、R單克隆抗體(monoclonal antibody，MAb);二是小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinaseinhibitor,TKI)。
　　 2.尼妥珠單抗抗腫瘤研究
　　 2.1、尼妥珠單抗抗腫瘤機(jī)制
　　 尼妥珠單抗是我國第一個以EGFR為靶點的人源化單克隆抗體。尼妥珠單抗可以與EGFR特異性結(jié)合，并通過占據(jù)EGFR分子的3A表位，競爭性抑制EGFR的天然配體EGF等與EGFR的結(jié)合，有效阻

7、斷經(jīng)EGFR介導(dǎo)的信號傳遞和細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和抑制新生血管的生成[8]。
　　 2.2、尼妥珠單抗臨床前研究
　　 尼妥珠單抗聯(lián)合伊立替康、氟尿嘧啶治療高表達(dá)EGFR的結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo，結(jié)果顯示尼妥株單抗可增強(qiáng)伊立替康、氟尿嘧啶的體外抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞死亡，表明尼妥珠單抗可以增強(qiáng)化療的抗腫瘤效應(yīng)[9]。尼妥珠單抗在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中的作用發(fā)現(xiàn)，與EGFR表達(dá)水平有關(guān)，而與是否存在EG

8、FR突變無關(guān)[10]。尼妥珠單抗對外陰鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的體內(nèi)外實驗均顯示抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、抑制VEGF介導(dǎo)的血管形成的作用，從而達(dá)到增強(qiáng)放療敏感性的[11]。以上研究證明尼妥珠單抗在體內(nèi)外均有增強(qiáng)放化療的抗腫瘤作用。
　　 2.3、尼妥珠單抗臨床研究
　　 尼妥珠單抗目前正在進(jìn)行結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等臨床研究，初步結(jié)果顯示尼妥珠單抗對多種腫瘤具有一定療效，值得進(jìn)一步研究。2004年

9、被批準(zhǔn)用于腦膠質(zhì)瘤，2009年批準(zhǔn)用于頭頸部腫瘤。
　　 2.3.1、尼妥珠單抗在腦膠質(zhì)瘤的臨床研究
　　 2009年汪洋等針對腦膠質(zhì)瘤的初步研究。試驗方法為:本試驗采用前瞻性研究，共17例患者，其中12例患者為新診斷的高分級腦膠質(zhì)瘤，放療總劑量為60Gy/30次，3例復(fù)發(fā)者的放療總劑量50Gy/25次，2例腦干復(fù)發(fā)者的放療總劑量為40Gy/20次:放療期間每天口服替莫唑胺50mg/m2，放療結(jié)束后休息4周后循環(huán)口服替莫

10、唑胺，第一個療程劑量為150mg/m2，連續(xù)口服5天，第二個療程起每天加量至200mg/m2，28天為1個療程。放療期間每周靜脈滴注尼妥珠單抗200mg(小于14歲患者用量為100mg)。研究結(jié)果:急性不良反應(yīng)多為Ⅰ-Ⅱ級，沒有Ⅲ級不良反應(yīng)，有1例因發(fā)生Ⅱ級濕疹樣皮炎，中斷尼妥珠單抗治療，16例患者的近期療效評價，其中PR4例、SD10例、PD2例。6個月無進(jìn)展生存率和總生存率分別為72.1％和86.3％。本研究的結(jié)論尼妥珠單抗聯(lián)合放療

11、加同期替莫唑胺治療高分級腦膠質(zhì)瘤反應(yīng)小，患者可以耐受，近期療效較好[12]。
　　 古巴進(jìn)行的一項尼妥珠單抗用于腦膠質(zhì)瘤的研究，成人和兒童尼妥珠單抗使用劑量分別為200mg、100mg，共有99例符合要求入組，58例可行療效評價，其中28例兒童組疾病控制率為89％(25/28)，其中11例CR、4例PR、10例SD，總生存率為78％(22/28);30例成人組疾病控制率為60％(18/30)，其中8例CR、1例PR、9例SD，總

12、生存率為63％(19/30)。僅有輕到中度毒副作用，可以耐受。該藥有望成為腦膠質(zhì)瘤的一線治療方案[11]。
　　 2.3.2、尼妥珠單抗在頭頸部腫瘤的臨床研究
　　 RodríguezMO等進(jìn)行的一項雙盲、隨機(jī)對照臨床研究，評價尼妥珠單抗聯(lián)合放療治療不能手術(shù)的晚期頭頸鱗癌患者的療效，共有106例患者入組，分為試驗組和對照組，試驗組采用尼妥珠單抗聯(lián)合放療，對照組采用安慰劑聯(lián)合放療。毒副作用表現(xiàn)為Ⅰ-Ⅱ級的乏力、發(fā)熱、頭痛、

13、畏寒，無皮疹，患者可以耐受。結(jié)果顯示在試驗組比對照組表現(xiàn)出較好的緩解率和生存質(zhì)量的提高[13]。
　　 2007年第六屆全國放射腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)會議關(guān)于尼妥珠單抗聯(lián)合放療治療局部晚期鼻咽癌的遠(yuǎn)期療效及毒副反應(yīng)，該試驗分為聯(lián)合治療組和單純放療組，聯(lián)合治療組和單純放療組的1、2、3、4年局部控制率分別為100％、83.33％、83.33％、、83.33％和100％、85.71％、57.14％、57.14％;兩組1、2、3、4年總生存率分別

14、為85.71％、85.71％、71.43％、71.43％和100％、85.71％、85.71％、68.57％，雖然上述數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異，但是尼妥珠單抗聯(lián)合放療治療局部晚期鼻咽癌有提高患者遠(yuǎn)期療效的趨勢，且安全可靠，未觀察到遠(yuǎn)期毒副作用[14]。
　　 3.療效檢測指標(biāo)—雙調(diào)蛋白
　　 3.1、雙調(diào)蛋白正常生理功能及異常病理功能
　　 雙向調(diào)節(jié)蛋白(amphiregulin/AREG/AR)是表皮生長因子(E

15、GF)家族中的一員，在不同組織細(xì)胞中有不同作用，既具有促進(jìn)生長作用又有抑制的雙重作用，因此稱為雙調(diào)蛋白。雙調(diào)蛋白的前體是一個有252個氨基酸組成的跨膜蛋白，成熟的分泌型雙調(diào)蛋白是一種糖蛋白，有84個氨基酸組成的，相對分子量為18-22x103。雙調(diào)蛋白在各種組織中均有表達(dá)，其中主要在泌尿生殖系統(tǒng)諸如乳腺、卵巢、子宮、胎盤、前列腺等，另外在胰腺、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸道及消化道亦有表達(dá)。雙調(diào)蛋白參與一系列的生理過程，包括乳腺發(fā)育、胚胎著床、骨的生

16、成、軸突生長、角質(zhì)增殖等等。雙調(diào)蛋白在腫瘤中有不同作用，包括在生長信號刺激下的自給自足作用、凋亡的逃避、無限制的復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成能力、侵襲及轉(zhuǎn)移能力、癌癥治療的抵抗作用[15]。
　　 3.2、雙調(diào)蛋白在腫瘤中的作用
　　 目前發(fā)現(xiàn)雙調(diào)蛋白在乳腺癌、肺癌、腸癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、膽道癌、皮膚癌、頭頸腫瘤、間充質(zhì)惡性腫瘤、惡性纖維組織瘤、骨髓瘤、血液學(xué)惡性腫瘤等等均高表達(dá)或者過表達(dá)[15

17、]。研究發(fā)現(xiàn)雙調(diào)蛋白在非小細(xì)胞肺癌伴腦轉(zhuǎn)移的患者中比原發(fā)腫瘤患者表達(dá)增加[16]。另外發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌原發(fā)灶雙調(diào)蛋白的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，針對肝轉(zhuǎn)移多因素分析證實，雙調(diào)蛋白的表達(dá)可作為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的獨立因素[17]。D'AntonioA等研究發(fā)雙調(diào)蛋白的表達(dá)與低分化和低增殖活性的卵巢癌存在顯著相關(guān)性[18]。在野生型K-ras基因結(jié)腸癌患者中，接受西妥昔單抗治療，檢測發(fā)現(xiàn)上皮調(diào)節(jié)蛋白和雙調(diào)蛋白表達(dá)高的患者，有效性更大[19]。EGF

18、R野生型雙調(diào)蛋白陽性的非小細(xì)胞患者可以從酪氨酸激酶抑制劑（易瑞沙、特羅凱）治療獲益[20]，在酪氨酸激酶抑制劑治療中，血清中高雙調(diào)蛋白，特定病生存率升高[21]?；谏鲜鲑Y料本研究選擇雙調(diào)蛋白作為尼妥珠單抗體外抑制作用檢測指標(biāo)。
　　 本課題通過研究尼妥珠單抗及順鉑聯(lián)合宮頸腺癌細(xì)胞Hela細(xì)胞在的體外抑制實驗，研究尼妥珠單抗對宮頸腺癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及雙調(diào)蛋白的影響，以探討其可能作用機(jī)制，宮頸腺癌的綜合治療、個體化治療提供理論

19、基礎(chǔ)。
　　 第一章：尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑對宮頸腺癌Hela細(xì)胞體外生長的抑制作用及對細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　 一、材料和方法：
　　 1.Hela細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5天傳一次代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為實驗用;
　　 2.用MTT法檢測Hela細(xì)胞生長曲線:設(shè)置正常組和空白對照組，細(xì)胞種板過夜后檢測OD值(490nm)，連續(xù)7天在同一時間檢測，并用SPSS繪制細(xì)胞

20、生長曲線;
　　 3.宮頸癌Hela細(xì)胞EGFR的表達(dá):待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80％后收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用RT-PCR檢測EGFR基因表達(dá)情況。
　　 4.將細(xì)胞分成4組，分別為尼妥珠單抗單藥組、順鉑單藥組、尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑組、空白對照組。檢測細(xì)胞增殖抑制率時尼妥珠單抗藥物濃度分別為12.5、25、50、75、100ug/ml; DDP藥物濃度分別0.75、1.5、3、6、12u

21、g/ml，分別于加藥后24h、48h、72h檢測。尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑組藥物濃度是0.75ug/ml+50ug/ml、1.5ug/ml+50ug/ml、3ug/ml+50ug/ml，藥物作用72h后檢測。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡時，尼妥珠單抗藥物濃度均為25、50、100ug/ml。
　　 5.采取上述分組，用MTT法檢測藥物對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制，根據(jù)OD值計算細(xì)胞生長抑制率。
　　 6.采用協(xié)同作用q值判

22、斷尼妥珠單抗和順鉑聯(lián)用的性質(zhì)，q=EAB/EA+EB-EAxEB，EAB是兩藥聯(lián)合的抑制率，EA、EB分別是藥物單藥抑制率。q＞1.15為協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15為相加作用，q＜0.85為拮抗作用。
　　 7.采取上述分組，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。
　　 8.統(tǒng)計處理:實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13統(tǒng)計軟件，各組間細(xì)胞抑制率比較采用析因設(shè)計的方差分析;細(xì)胞周期

23、及細(xì)胞凋亡率結(jié)果采用單因素方差分析(one-way ANOVA);多重比較采用LSD檢驗或Dunnett's T3檢驗。P≤0.05（雙側(cè)）表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 二、結(jié)果：
　　 1.宮頸癌Hela細(xì)胞生長曲線:
　　 從生長曲線觀察，種板后的Hela細(xì)胞第1-7天均呈指數(shù)生長，其中第4-7天生長最快，之后開始逐漸減慢。
　　 2.宮頸癌Hela細(xì)胞EGFR的表達(dá):通過RT-PCR的定性檢測，證明He

24、la細(xì)胞存在EGFR表達(dá)。
　　 3.尼妥珠單抗聯(lián)合DDP對人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長抑制作用。
　　 經(jīng)MTT法檢測，不同濃度、不同時間尼妥珠單抗或順鉑單藥對人宮頸腺癌細(xì)胞Hela均有抑制作用，并隨著濃度的增高及時間的延長其抑制率顯著增高(P均＜0.05)。尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑（50ug/ml+0.75ug/ml、50ug/ml+1.5ug/ml、50ug/ml+3ug/ml），藥物聯(lián)合呈相加作用。
　　 4.尼

25、妥珠單抗單藥對人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響。
　　 對照組和25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml組的G0/G1期、S期、G2/M期比率間有顯著差異（P均＜0.05）。G0/G1期隨著濃度的增高其比率呈上升趨勢，而G2/M期、S期則相反，呈下降趨勢。
　　 5.尼妥珠單抗對人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響。
　　 尼妥珠單抗能夠顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，且隨給藥劑量的增加，凋亡率增高，較對照組均有統(tǒng)計學(xué)

26、差異(P＜0.05)。
　　 第二章：尼妥株單抗對宮頸腺癌Hela細(xì)胞雙調(diào)蛋白表達(dá)的影響
　　 一、材料和方法：
　　 1.Hela細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3-5天傳一次代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為實驗用;
　　 2.實驗分為對照組，尼妥珠單抗單藥組(25ug/ml、50ug/ml、75ug/ml)，加藥培養(yǎng)72h后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR檢測Hela細(xì)胞雙調(diào)蛋白基因

27、的表達(dá)變化。
　　 3.統(tǒng)計方法:所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析（one-way ANOVA）;多重比較均采用LSD檢驗。取P≤0.05（雙側(cè)）表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、結(jié)果：
　　 與對照組相比，尼妥珠單抗單藥組(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)雙調(diào)蛋白基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），且隨著藥

28、物濃度的升高，雙調(diào)蛋白基因表達(dá)上升。
　　 三、結(jié)論：
　　 EGFR基因在宮頸癌Hela細(xì)胞中表達(dá)，可以作為宮頸癌治療靶點。尼妥珠單抗單藥、順鉑單藥對宮頸癌Hela細(xì)胞均有抑制增殖作用，呈劑量和時間依賴性;兩藥聯(lián)合表現(xiàn)為相加作用。尼妥珠單抗單藥作用Hela細(xì)胞后，細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞較對照組顯著增多，S、G2/M期細(xì)胞則較對照組顯著減少。尼妥珠單抗能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，并隨給藥劑量的增加，凋亡率顯著增高