自噬復合體ATG5-ATG12促進Ⅰ型干擾素信號轉導對口蹄疫病毒復制的影響.pdf

1、口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)感染偶蹄類動物所引發(fā)的一種急性烈性傳染病。天然免疫作為機體抗病毒感染的第一道防線，細胞內的模式識別受體通過識別病毒核酸或病毒產物，激活一系列級聯反應、誘導I型干擾素和抗病毒因子的產生，最終實現抗病感染效果。
　　細胞自噬是真核細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種重要的生命活動，是細胞內主要依賴于溶酶體的一

2、種降解途徑，通過將機體不需要的生物大分子包裹形成自噬體，并與溶酶體融合從而將內容物降解，自噬與許多疾病的發(fā)生密切相關，自噬也具有清除病原體的功能，這一功能通常與天然免疫密切相關，最終抵御病原微生物的感染。ATG5-ATG12復合物是自噬過程中的重要復合體，在自噬體膜的延伸過程中發(fā)揮著重要作用，自噬的許多功能與ATG5有關，下調ATG5-ATG12能有效阻斷自噬，而且發(fā)現 ATG5參與調控 I型干擾素的表達。因此，研究自噬蛋白復合物 AT

3、G5-ATG12抗病毒的作用機制，將為抗病毒藥物的研制和疫苗的開發(fā)提供理論基礎。
　　先前有研究表明 FMDV可激活細胞自噬，本研究將根據這一現象進一步追蹤口蹄疫病毒誘導自噬的分子機制以及自噬復合體ATG5-ATG12與天然免疫的調控關系。首先為了確定口蹄疫病毒是否能誘導宿主細胞系豬腎傳代細胞(PK-15)細胞的自噬以及自噬復合體 ATG5-ATG12的誘導表達情況，選擇PK-15為研究對象，通過共聚焦激光顯微鏡技術和蛋白免疫印跡

4、（Western blot）方法確定了自噬標志蛋白 LC3-II/LC3-I的變化并檢測了ATG5-ATG12蛋白的表達水平隨FMDV感染的的規(guī)律；為了進一步確定自噬復合體ATG5-ATG12是否促進細胞抗病毒天然免疫，通過過表達ATG5-ATG12，分別利用Western blot、熒光定量PCR和TCID50試驗，從蛋白、基因及病毒滴度等不同水平確定FMDV復制與ATG5-ATG12的關系，隨后進一步利用Western blot和熒

5、光定量PCR分析細胞因子及炎癥因子IFN-β、IL-6、CXCL10、PKR和MX1的表達情況；為了證實ATG5-ATG12是否通過調控NF-κB信號進一步調節(jié)I型干擾素的轉錄，通過過表達ATG5-ATG12或抑制ATG5-ATG12表達的方法，以Western blot檢測I型干擾素通路的關鍵分子NF-κB/p65的表達水平，IκBα的磷酸化水平以及降解水平等，并進一步通過共聚焦激光顯微鏡追蹤p65在細胞中的定位。
　　結果顯示

6、，口蹄疫病毒能夠誘導 PK-15細胞的自噬以及自噬復合體 ATG5-ATG12的表達， ATG5-ATG12的過表達能抑制FMDV的復制，這一抑制現象是通過ATG5-ATG12促進NF-κB信號通路并進一步促進IFN-β的表達得以實現的。以上結果在豬腎細胞（IBRS-2）中有相似結果，但在I型干擾素缺陷的幼倉鼠腎細胞（BHK-21）中，ATG5-ATG12并不能抑制FMDV的復制，這從另一角度證實，ATG5-ATG12通過促進I型干擾素