抗EBV LMP2A單克隆抗體的制備、鑒定及免疫學特性分析.pdf

1、目的:
　　EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬人類γ皰疹病毒，在全球廣泛分布，約95％以上的成人所攜帶，呈潛伏感染狀態(tài)，與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關。在EBV潛伏感染的細胞中，表達十多種EBV基因產物，包括EBV核抗原(EB nuclear antigen，EBNA)1、2、3A、3B、3C和LP，潛伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP)1和2A、2B

2、，EBV編碼的小RNA(EBER)1和2以及BamHⅠ的轉錄產物。近年許多關于LMP2A的研究報道指出，EBV潛伏感染的B細胞中均有LMP2A的表達，鼻咽癌和其他EBV相關惡性腫瘤中可持續(xù)檢測到LMP2A的轉錄表達產物(mRNA)，LMP2A可在沒有BCR提供信號的情況下促進B細胞的增殖和存活，并且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等腫瘤細胞穩(wěn)定表達的EBV保守抗原，在維持病毒的潛伏感染狀態(tài)和細胞轉化過程中發(fā)揮重要作用，并參與調節(jié)跨膜信號的轉導

3、。目前認為LMP2A是鼻咽癌等EBV相關惡性腫瘤免疫治療的理想靶抗原。
　　本研究運用基因工程技術選擇抗原性較強的兩個LMP2A胞外區(qū)表位基因并將其串聯(lián)，連接載體后導入大腸桿菌中表達LMP2A表位融合蛋白，并檢測其免疫原性;應用雜交瘤技術，制備抗LMP2A的特異性單克隆抗體，對該單克隆抗體進行鑒定和免疫學功能分析;應用純化后的單克隆抗體進行EBV相關鼻咽癌病人的免疫組化檢測，為進一步進行鼻咽癌診斷和分子靶向治療奠定基礎。
　

4、　方法:
　　1.LMP2A重組表位融合蛋白基因的串聯(lián)以及構建融合蛋白原核表達載體
　　依據(jù)Genebank中的LMP2A基因序列以及大量相關文獻，且經軟件分析后選擇抗原性較強的LMP2A第二位和第五位表位基因，優(yōu)化LMP2A表位基因序列并將LMP2A第二、五胞外區(qū)基因串聯(lián)，限制內切酶在5'端和3'端雙酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，將重組串聯(lián)基因克隆于pET28a原核表達載體中，構建LMP2A表位融合蛋白的重組表達

5、載體。
　　2.LMP2A重組表位融合蛋白的表達、純化與鑒定
　　將原核重組表達載體pET28a-LMP2A轉化至大腸埃希菌BL21中誘導LMP2A融合蛋白的表達。表達的蛋白變性處理后用Ni-NTA親和層析柱純化，復性后進行SDS-PAGE電泳并用Coomassie blue染色、脫色、鑒定蛋白純度。用商品化大鼠抗人LMP2A IgG對純化后的LMP2A重組表位融合蛋白進行Westernblotting鑒定。
　　3.

6、抗LMP2A單克隆抗體的制備與純化
　　以純化后的LMP2A重組表位融合蛋白作為抗原免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，經克隆以及多次亞克隆后篩選出能夠穩(wěn)定分泌鼠抗人LMP2A的雜交瘤細胞株。取雜交瘤細胞注射入小鼠腹腔經腹水誘生方法產生腹水。經親和層析柱Protein G純化，測定抗體濃度。
　　4.抗LMP2A單克隆抗體的亞類分析、鑒定及免疫學功能分析
　　純化后的單克隆抗體經免疫

7、球蛋白亞類測定試劑盒測定抗體的亞類，ELISA測定其效價，SDS-PAGE鑒定抗體重輕鏈，以及一系列免疫學功能分析，包括Western blotting、免疫熒光、流式細胞術等。
　　5.單克隆抗體的免疫組化檢測
　　收集33例鼻咽癌患者組織石蠟標本，切片脫蠟至水，以純化后單克隆抗體為一抗并以無關抗體作為對照，檢測EB病毒相關鼻咽癌病人組織切片中LMP2A蛋白的表達。
　　結果:
　　1.EB病毒LMP2A重組表

8、位融合蛋白基因的構建、蛋白的表達與純化
　　經DNAstar軟件分析LMP2A編碼基因序列，LMP2A第二、五胞外區(qū)重復串聯(lián)基因與原先設計的目的蛋白序列一致，轉化大腸埃希菌BL21，誘導表達的LMP2A重組融合蛋白純化后經Western blotting，SDS-PAGE鑒定，提示蛋白的分子量約為12KDa。運用該融合蛋白制備的血清抗體經ELISA及SDS-PAGE、Western blotting檢測提示該融合蛋白效價高且具有較

9、好的免疫原性。
　　2.抗LMP2A單克隆抗體的制備、鑒定與免疫學功能分析
　　以LMP2A重組表位融合蛋白為抗原免疫小鼠，經兩次亞克隆篩選出一株穩(wěn)定分泌抗LMP2A抗體的雜交瘤細胞株，定株命名為5C12-C4-A6。取雜交瘤細胞注射小鼠腹腔產腹水純化后，亞類分析為IgG1，輕鏈為κ，ELISA結果提示該抗體效價在1∶128000以上，Western blotting、免疫熒光、流式細胞術結果均提示該抗體能夠與細胞中的LMP

10、2A蛋白特異性結合。
　　3.抗LMP2A單克隆抗體的臨床相關應用
　　收集33例鼻咽癌患者組織石蠟標本，以抗LMP2A單克隆抗體為一抗進行免疫組化檢測，在33例鼻咽癌組織切片中31例出現(xiàn)陽性反應，定位在胞膜與胞漿，陽性率為93.94％，結果提示該抗體能夠與鼻咽癌組織中天然構象的LMP2A抗原特異性結合。
　　結論:
　　本研究成功構建并表達了LMP2A重組串聯(lián)表位融合蛋白;并利用純化后的融合蛋白制備出了一株抗人