柑橘全爪螨谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶解毒代謝功能研究.pdf

1、柑橘全爪螨（Panonychus citri（McGregor））是一種世界性分布的多食性害螨，可取食包括草本和木本在內(nèi)的106種寄主植物，但主要危害柑橘類果樹。目前對于柑橘全爪螨的防治仍然以化學(xué)藥劑為主。然而，由于該螨發(fā)育歷期短、世代重疊、繁殖力強(qiáng)等自身特點(diǎn)，加之田間殺螨劑的不科學(xué)使用等客觀因素，導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生并迅速發(fā)展。針對柑橘全爪螨田間抗性水平監(jiān)測及抗性機(jī)理的研究將有助于為有效防控策略的制訂提供重要的理論指導(dǎo)。目前對介導(dǎo)昆蟲（螨）

2、抗藥性的機(jī)理研究主要圍繞靶標(biāo)抗性以及代謝抗性兩個方面。其中，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases,GSTs;EC2.5.1.18）作為生物體內(nèi)重要的解毒代謝酶之一，在生物體對內(nèi)源或外源物質(zhì)的解毒代謝過程中具有重要作用，而且，GSTs還參與抗氧化脅迫保護(hù)。已有研究報道證實(shí)，GSTs參與昆蟲（螨）對殺蟲（螨）劑的解毒代謝，進(jìn)而介導(dǎo)昆蟲（螨）抗性的發(fā)生及發(fā)展。迄今，關(guān)于柑橘全爪螨GSTs的研究相對滯后，對柑

3、橘全爪螨GSTs的功能研究及其介導(dǎo)的抗性機(jī)理更是鮮有報道。
　　據(jù)此，為全面闡釋柑橘全爪螨GSTs介導(dǎo)代謝抗性的分子機(jī)理，本學(xué)位論文在對柑橘全爪螨重慶地區(qū)田間種群抗性水平監(jiān)測獲得相關(guān)殺螨劑抗性種群的的基礎(chǔ)上，通過分析轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，克隆獲得柑橘全爪螨GSTs基因的cDNA全長序列，系統(tǒng)分析這些基因的分子生物學(xué)信息；利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得柑橘全爪螨 GSTs的重組蛋白并比較分析其酶學(xué)特性；采用高效液相色譜（high performan

4、ce liquid chromatograph,HPLC）技術(shù)檢測并分析GSTs與殺螨劑之間的相互作用關(guān)系；應(yīng)用RT-qPCR（real time quqntitative-PCR）技術(shù)解析GSTs基因在柑橘全爪螨不同發(fā)育階段、藥劑脅迫以及不良環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式，預(yù)測潛在的生理功能；研究并建立柑橘全爪螨RNAi體系，解析柑橘全爪螨GSTs對殺螨劑的解毒代謝功能；最后，利用高通量測序技術(shù)篩選鑒定柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性相關(guān)基因，探討甲氰菊

5、酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的代謝途徑。本研究旨在全面解析柑橘全爪螨GSTs的解毒代謝功能及其介導(dǎo)的抗藥性機(jī)理，為柑橘全爪螨田間抗藥性的治理提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。本學(xué)位論文的主要研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　1.柑橘全爪螨田間種群的抗藥性監(jiān)測
　　采用葉片浸漬法于2014年對柑橘全爪螨重慶地區(qū)4個種群（萬州、奉節(jié)、武隆和北碚）對常用殺螨劑的抗藥性水平進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果顯示，4個種群對甲氰菊酯均產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。其中，甲氰菊酯對奉節(jié)種群和北碚

6、種群的LC50值相對較高，分別為7.14 mg/L和5.30 mg/L，相對抗性水平達(dá)310和230倍；對萬州種群的LC50相對較低（1.23 mg/L），相對抗性倍數(shù)為53倍；而對武隆種群的LC50值與敏感種群相近，相對抗性倍數(shù)僅為4倍。阿維菌素對柑橘全爪螨萬州種群的LC50值較高，相對抗性倍數(shù)達(dá)14倍；噠螨靈對柑橘全爪螨奉節(jié)種群的相對抗性為12倍。柑橘全爪螨4個種群對新型殺螨劑丁氟螨酯較為敏感且均未產(chǎn)生抗藥性。
　　2.柑橘全

7、爪螨GSTs基因的克隆及序列分析
　　在分析篩選轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆獲得柑橘全爪螨10個GSTs基因的cDNA全長序列，通過序列同源比對將這10個 GSTs基因分別歸類為 delta（3）、mu（5）、omega（1）和zeta（1）4個家族。分子生物學(xué)信息分析結(jié)果顯示，10個GSTs基因的cDNA全長序列介于822-1289 bp之間，開

8、放閱讀框長度范圍為645-735 bp，推導(dǎo)的氨基酸序列長度介于217-244個氨基酸殘基，所編碼蛋白的相對分子量大小范圍為23.9-27.7 kDa，理論等電點(diǎn)范圍為5.18-7.65。序列多重比對結(jié)果顯示，10個GSTs基因的核苷酸序列同源性范圍在33.1-66.4％之間，氨基酸序列同源性范圍在10.9-60.8%之間。
　　選取蜱螨亞綱二斑葉螨（Tetranychus urticae）32個 GSTs基因和肩突硬蜱（Ixod

9、es scapularis）16個GSTs基因以及昆蟲綱家蠶（Bombyx mori）20個GSTs基因作為參考，對柑橘全爪螨10個GSTs基因推導(dǎo)的氨基酸序列采用最大似然法通過MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，柑橘全爪螨10個GSTs與二斑葉螨GSTs的同源性最高，分別與其相應(yīng)的4個家族（delta、mu、omega和zeta）的GSTs聚在一起。結(jié)合二斑葉螨GSTs基因推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對分析，預(yù)測柑橘全爪螨4個家族

10、GSTs的的催化活性位點(diǎn)分別位于Ser11（delta家族）、Tyr33（mu家族）、Cys32（omega家族）和Ser14（zeta家族）。
　　柑橘全爪螨10個GSTs基因序列經(jīng)分析驗(yàn)證后登錄至GenBank，基因名稱及相應(yīng)的登錄號分別為：PcGSTm1（JQ069034）、PcGSTm2（JQ069035）、PcGSTm3（JX846609）、PcGSTm4（JX846610）、PcGSTm5（KT717379）、PcGS

11、Td1（JQ069033）、PcGSTd2（JQ069037）、PcGSTd3（KU904396）、PcGSTz1（JQ069036）和PcGSTo1（KU904397）。
　　3.柑橘全爪螨GSTs基因的原核表達(dá)及酶學(xué)特性分析
　　采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)并純化獲得柑橘全爪螨10個GSTs基因的重組蛋白，SDS-PAGE及Western blot技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果顯示重組蛋白的質(zhì)量較高。以CDNB（1-chloro-2,4

12、 dinitrobenzene）為底物，對10個GSTs重組蛋白的催化活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，10個GSTs均具有催化CDNB與GSH（glutathione）反應(yīng)的活性，但活性高低存在差異。其中，PcGSTm5和PcGSTd1的催化活性顯著高于其余8個GSTs。熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示柑橘全爪螨重組GSTs在不高于50℃的條件下均能保持較高的活性，說明重組蛋白的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。最適pH測定結(jié)果顯示柑橘全爪螨10個GSTs均在pH7.5條件下

13、催化活性最高，表明重組蛋白最適酶促反應(yīng)環(huán)境均為中偏堿性。對重組蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明PcGSTm3與CDNB的親和能力最強(qiáng)。以過氧化氫異丙苯為底物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示柑橘全爪螨10個GSTs重組蛋白有一定的過氧化物酶活性。對重組蛋白離體抑制作用測定結(jié)果顯示，與特異性抑制劑利尿酸相比較，阿維菌素和甲氰菊酯均不能有效抑制柑橘全爪螨10個GSTs的催化活性。
　　4.柑橘全爪螨GSTs基因的表達(dá)模式分析
　　采用

14、RT-qPCR技術(shù)，解析柑橘全爪螨10個GSTs基因在不同發(fā)育階段、殺螨劑脅迫以及極端高溫脅迫后的表達(dá)模式。
　　4.1.柑橘全爪螨GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析
　　柑橘全爪螨10個GSTs基因在4個發(fā)育階段（卵、幼螨、若螨和成螨）均有所表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。其中，PcGSTm5和PcGSTo1在幼螨、若螨和成螨期的表達(dá)水平顯著高于卵期。然而，PcGSTm2、PcGSTm3和PcGSTd3在4個發(fā)育階段的表達(dá)

15、量無顯著性差異變化。GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性暗示其功能可能具有多樣性。
　　4.2.柑橘全爪螨GSTs基因應(yīng)對殺螨劑脅迫的表達(dá)模式分析
　　經(jīng)不同殺螨劑亞致死濃度脅迫處理后，柑橘全爪螨10個GSTs基因的應(yīng)激表達(dá)模式存在差異。其中，阿維菌素能夠誘導(dǎo)PcGSTm3、PcGSTm4、PcGSTm5和PcGSTd1的mRNA水平顯著上調(diào)，尤其PcGSTm5的上調(diào)幅度最高。擬除蟲菊酯類殺螨劑甲氰菊酯脅迫處理后，PcGS

16、Tm2、PcGSTm3和PcGSTd1的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度上調(diào)。然而，柑橘全爪螨GSTs基因?qū)€粒體傳遞鏈抑制劑噠螨靈的脅迫響應(yīng)相對較弱，10個GSTs基因的mRNA表達(dá)水平與對照相比均無顯著性差異。此外，經(jīng)寄主植物次生代謝物檸檬醛脅迫處理后，柑橘全爪螨GSTs基因積極響應(yīng)，在脅迫處理后12 h，PcGSTm1、PcGSTm3、PcGSTm4和PcGSTd1的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)。綜合分析，經(jīng)阿維菌素、甲氰菊酯和檸檬醛脅迫處理后表達(dá)

17、水平出現(xiàn)上調(diào)的GSTs基因有可能參與對相應(yīng)藥劑的解毒代謝過程。
　　4.3.柑橘全爪螨GSTs基因應(yīng)對高溫脅迫的表達(dá)模式分析
　　柑橘全爪螨在41℃高溫條件下脅迫處理3 h，其體內(nèi)多數(shù)GSTs基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其中，PcGSTd1的表達(dá)水平上調(diào)幅度最為明顯，達(dá)對照的30倍。暗示GSTs可能通過其抗氧化功能，避免柑橘全爪螨受到由極端溫度引起的氧化脅迫傷害。
　　5.柑橘全爪螨GSTs基因的解毒代謝功能分析
　　5.

18、1.柑橘全爪螨GSTs基因PcGSTm5對阿維菌素的解毒代謝功能分析
　　采用RT-qPCR技術(shù)，分析柑橘全爪螨阿維菌素抗性及敏感品系GSTs基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PcGSTm5在抗性種群表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步采用RNAi技術(shù)干擾PcGSTm5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PcGSTm5有效沉默后（沉默效率65%）柑橘全爪螨對阿維菌素的敏感性顯著升高，RNAi處理與對照的死亡率分別為55.6%和23.0%，表明PcGSTm5可能參與柑橘全爪螨對阿維菌

19、素的解毒代謝。但是，采用HPLC進(jìn)行藥劑離體代謝作用分析，結(jié)果顯示尚無證據(jù)表明PcGSTm5能夠直接代謝阿維菌素。綜合分析，PcGSTm5可能參與阿維菌素的解毒代謝，進(jìn)而介導(dǎo)柑橘全爪螨對阿維菌素的抗藥性。
　　5.2.柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性與敏感品系比較轉(zhuǎn)錄組分析
　　借助高通量測序技術(shù)，對柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性和敏感品系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并在此基礎(chǔ)上通過比較轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)抗性和敏感品系間差異表達(dá)的基因861個，其中，499

20、個基因在抗性種群表達(dá)上調(diào)，362個基因在抗性種群表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步注釋499個上調(diào)表達(dá)基因的功能，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因包括解毒代謝酶（P450s、GSTs、CarEs）、熱激蛋白、表皮蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及抗氧化酶基因等，且熱激蛋白、表皮蛋白以及抗氧化酶基因的上調(diào)倍數(shù)相對較高。推測上述基因可能共同參與甲氰菊酯的解毒代謝，據(jù)此提出了甲氰菊酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的解毒代謝途徑。
　　5.3.柑橘全爪螨GSTs基因PcGSTd1對甲氰菊酯的解毒代謝

21、功能解析
　　采用RT-qPCR技術(shù)，分析柑橘全爪螨甲氰菊酯抗性及敏感品系GSTs基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，除PcGSTm1、PcGSTd3和PcGSTo1以外，其余7個GSTs基因均在甲氰菊酯抗性種群過量表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果同樣顯示，PcGSTd1在甲氰菊酯抗性種群過量表達(dá)。但是采用 HPLC進(jìn)行藥劑離體代謝作用分析，結(jié)果顯示尚無充分證據(jù)表明PcGSTd1能夠直接催化代謝甲氰菊酯。采用RNAi技術(shù)有效沉默該基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Pc

22、GSTd1可能參與調(diào)節(jié)柑橘全爪螨體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，保護(hù)柑橘全爪螨免受由甲氰菊酯引起的氧化脅迫傷害。據(jù)此推測，PcGSTd1可能是柑橘全爪螨對抗甲氰菊酯的充分但非必要因素。
　　綜上所述，本學(xué)位論文研究在柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組分析篩選的基礎(chǔ)上，通過RACE技術(shù)克隆獲得了10個柑橘全爪螨GSTs基因的cDNA全長序列，詳盡分析了序列的分子生物學(xué)信息；利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了這些GSTs基因的重組蛋白，并比較分析了酶學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)PcG

23、STm5和PcGSTd1的重組蛋白具有相對較高的催化活性，暗示其在柑橘全爪螨GSTs超基因家族中可能占據(jù)重要地位；通過RT-qPCR技術(shù)，解析了柑橘全爪螨GSTs基因在不同發(fā)育階段、藥劑脅迫以及極端溫度脅迫條件下的表達(dá)模式，推測相關(guān)上調(diào)GSTs基因可能參與阿維菌素、甲氰菊酯以及檸檬醛的解毒代謝過程；成功建立了柑橘全爪螨RNAi體系，在此基礎(chǔ)上證明PcGSTm5可能參與柑橘全爪螨對阿維菌素的解毒代謝，進(jìn)而介導(dǎo)柑橘全爪螨對阿維菌素的抗藥性；

24、RT-qPCR以及轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果均表明，PcGSTd1的過量表達(dá)可能與柑橘全爪螨對甲氰菊酯的抗藥性相關(guān)；此外，通過比較轉(zhuǎn)錄組分析篩選出甲氰菊酯抗性相關(guān)基因，探討并提出包括具有抗氧化功能的PcGSTd1在內(nèi)的甲氰菊酯在柑橘全爪螨體內(nèi)的解毒代謝途徑。本研究首次從分子生物學(xué)水平對柑橘全爪螨GSTs基因的序列信息、酶學(xué)特性、表達(dá)模式及其解毒代謝功能進(jìn)行了較為全面深入地解析。所獲得的研究結(jié)果及結(jié)論，將為柑橘全爪螨田間抗藥性的治理以及新型有效防控策