hSulF-1基因腺病毒表達載體的構建及其抗腫瘤機制的實驗研究.pdf

1、人硫酸酯酶1(humansulfatase1，hSulf-1)是一個細胞生長的負向調控因子，在人體正常組織中恒定表達，而在絕大多數的腫瘤細胞系和腫瘤組織中（如乳腺癌、胰腺癌、腎臟癌、肝細胞癌等）表達水平下調。已有研究證明，腫瘤細胞中hSulf-1基因的再表達會導致細胞增殖、遷移、侵襲能力有所減弱，同時促進藥物誘導的腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤發(fā)生和血管形成。hSulf-1基因編碼一種芳基硫酸酯酶，在細胞外間質中降低硫酸肝素糖胺聚糖的硫酸化程

2、度，進而影響與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)密切相關的多種胞外信號分子與其相應受體結合的過程，從而改變多種信號通路的活性。本研究旨在通過構建的腺病毒載體將目的基因hSulf-1運送到血管內皮細胞和腫瘤細胞中，在體內外研究hSulf-1蛋白對于細胞增殖與遷移能力的影響，為臨床上腫瘤的基因治療提供了新的分子靶標。
　　 第一部分，hSulf-1基因腺病毒表達載體的構建
　　 [目的]：克隆人硫酸酯酶1(hSulf-1)基因

3、并構建穩(wěn)定表達的腺病毒載體Ad5-hSulf1;
　　 [方法]：采用PCR方法從pcDNA3.1-hSulf1質粒中擴增hSulf-1基因，插入到腺病毒質粒載體pDC315的多克隆位點區(qū)，構建pDC315-hSulf1。利用轉染試劑，將pDC315-hSulf1與腺病毒包裝質粒一起轉入HEK293細胞中，得到重組腺病毒Ad5-hSulf1。PCR鑒定同時進行DNA測序，鑒定正確后，大量擴增并純化。同樣的方法構建攜帶增強型綠色熒

4、光蛋白基因(EGFP)的對照腺病毒Ad5-EGFP。TCID50法測定病毒滴度。
　　 [結果]：PCR鑒定和測序結果都證實，hSulf-1基因腺病毒表達載體Ad5-hSulf1構建成功。TCID50法測病毒滴度，Ad5-hSulf1為1.15×1010pfu/mL(plaqueformingunit/mL)，對照病毒Ad5-EGFP滴度為1.80×108pfu/mL。
　　 [結論]：成功構建了hSulf-1基因腺病毒

5、表達載體Ad5-hSulf1，為進一步體內外研究奠定了基礎。
　　 第二部分，hSulf-1基因的過表達對血管內皮細胞增殖遷移能力的影響
　　 [目的]：研究hSulf-1基因的過表達對于人臍靜脈內皮細胞ECV-304增殖、遷移能力的影響。
　　 [方法]：應用蛋白質免疫印跡法檢測hSulf-1基因在ECV-304細胞中的表達及細胞內磷酸化Akt、ERK的表達變化;MTT實驗檢測hSulf-1過表達對于ECV-3

6、04細胞增殖的影響;采用劃痕實驗研究hSulf-1過表達對于ECV-304細胞遷移的影響。
　　 [結果]：免疫印跡結果表明hSulf-1基因過表達會下調ECV-304細胞Akt和ERK信號分子的磷酸化水平;細胞增殖實驗結果表明hSulf-1基因過表達抑制了ECV-304細胞增殖，感染復數為50，100時細胞存活率下降至(68.49±0.05)％以及（67.78±0.06）％;劃痕實驗結果表明hSulf-1基因過表達能夠抑制細胞

7、的遷移，實驗組相比于對照組，細胞遷移能力明顯減弱(P＜0.01)。
　　 [結論]：重組腺病毒Ad5-hSulf1介導的hSulf-1基因在ECV-304細胞中的過表達明顯抑制細胞增殖及遷移，為hSulf-1用于腫瘤及血管生長相關疾病的基因治療奠定了基礎。
　　 第三部分，hSulf-1基因通過下調VEGFR2信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應的體外實驗研究
　　 [目的]：通過體外實驗研究hSulf-1基因如何通過影響VE

8、GFR2信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應。
　　 [方法]：通過對不同腫瘤組織標本免疫組化檢測hSulf-1基因的表達情況;Westernblotting檢測肝癌、卵巢癌細胞中導入hSulf-1基因以及干擾hSulf-1基因后VEGFR2的表達變化;MTT實驗分別檢測hSulf-1基因的表達，VEGFR2的沉默以及兩者聯合對于肝癌、卵巢癌細胞增殖的影響。
　　 [結果]：在肝癌，乳腺癌，胃癌，腎癌，和結腸癌樣本的免疫組化結果顯示h

9、Sulf-1基因的陽性表達率分別為23.1％、16.7％、31.8％、11.1％、44.4％，相比于hSulf-1陰性的肝癌，hSulf-1陽性的肝癌組織樣本p-VEGFR2Tyr1175的表達水平明顯下降(P＜0.05)，而t-VEGFR2的表達水平無明顯區(qū)別(P＞0.05);Westernblotting結果顯示肝癌、卵巢癌細胞中成功導入hSulf-1基因后p-VEGFR2Tyr1175的表達水平明顯下降(P＜0.05)，干擾hSu

10、lf-1表達后p-VEGFR2Tyrl175的表達水平恢復到正常水平;MTT實驗結果表明hSulf-1基因的表達，VEGFR2的沉默都會導致肝癌、卵巢癌細胞存活率下降，兩者聯合后腫瘤細胞存活率進一步降低。
　　 [結論]：在大多數人類腫瘤中，hSulf-1基因失活是一個普遍的現象;在肝癌和卵巢癌細胞中，hSulf-1基因的表達會下凋p_VEGFR2Tyr1175的表達水平，腫瘤細胞增殖能力減弱。
　　 第四部分，裸鼠腫瘤

11、模型的建立及研究hSulf-1基因的表達對瘤內血管密度和腫瘤生長的影響
　　 [目的]：建立小鼠腫瘤模型，通過體內實驗研究hSulf-1基因的表達對于小鼠腫瘤生長以及瘤內血管生長的影響。
　　 [方法]：建立小鼠肝癌、卵巢癌移植瘤模型，給予hSulf-1基因治療，觀察移植瘤的生長情況，免疫組化及Westernblotting驗證hSulf-1對移植瘤血管密度及信號通路的影響;
　　 [結果]：成功建立小鼠肝癌、卵

12、巢癌移植瘤模型，兩個模型中都表現為Ad5-hSulf1組腫瘤生長抑制最為明顯，與空白對照組相比，卵巢癌模型組抑制率為46.19％，肝癌模型組抑制率為49.56％(P＜0.01);而陰性對照組與空白對照組之間無明顯差別(P＞0.05)。剝離卵巢癌移植瘤瘤體，Ad5-hSulf1組瘤體的質量相比于另外兩組明顯小(P＜0.01);CD31免疫組化結果顯示，Ad5-hSulf1組和對照組的血管密度分別為24.67±6.51和2.33±12.34

13、，二者差異明顯(P＜0.05);Westernblot和免疫組化結果顯示，與對照組相比，Ad5-hSulf1組中p-VEGFR2Tyr1175和p-AKTThr308表達均下調。
　　 [結論]：以裸鼠為實驗動物分別建立卵巢癌SKOV3細胞成瘤模型和肝癌BEL-7404細胞成瘤模型。用腺病毒Ad5-hSulf1對其進行治療，同時設置對照組。結果顯示Ad5-hSulf1治療后腫瘤生長受阻，p-VEGFR2Tyr1175和p-AKT