N-糖基化和經(jīng)典Wnt信號通路促進Cthrcl的表達及其促進口腔癌細胞轉(zhuǎn)移的功能.pdf

1、背景和目的:
　　 Cthrc1首先在受傷的大鼠血管中發(fā)現(xiàn)，它是一種分泌型的糖基化蛋白，具有抑制膠原表達和促進細胞運動的功能。在TGF-β家族的成員(BMP4，BMP2，TGF-β)的影響下，Cthrc1在纖維母細胞和軟骨細胞中的表達升高。Cthrc1也跟很多重要的信號通路有關(guān)系，比如Wnt和TGF-β。體內(nèi)外實驗?zāi)Ｐ投甲C明了Cthrc1抑制TGF-β信號通路的功能是通過減少Smad2和Smad3的磷酸化實現(xiàn)的。Cthrc1在腫

2、瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的表達升高，但是它在其過程中的作用還不清楚。最近的研究證明Cthrc1可以激活Wnt/PCP信號通路，它是非經(jīng)典Wnt途徑的一種。Cthrc1的激活狀態(tài)是一種錨在細胞膜表面的一種N末端糖基化的三聚體。雖然Cthrc1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的表達升高，但是其過表達的機制和其在病理過程中的功能還不清楚。
　　 Wnt/PCP信號通路在惡性腫瘤的發(fā)展中起著復(fù)雜的作用。在惡性腫瘤的早期階段，Wnt/PCP通過抑制Wnt/β信

3、號通路來抑制腫瘤的發(fā)展。隨著腫瘤的成長，在腫瘤的晚期階段，Wnt/PCP被激活并且可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，從而促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移。先前的研究證明了Wnt/β信號通路在口腔鱗狀細胞癌中是激活的狀態(tài)。并且我們過去的研究也報道了，在口腔鱗狀細胞癌中E-cadherin的大量的N末端糖基化引起的細胞之間粘附的松解。E-cadherin的過度的糖基化又是由于DPAGT1的過表達引起的，DPAGT1是N末端糖基化的重要的調(diào)節(jié)基因。然而，我們近期

4、的研究顯示，DPAGT1基因又是經(jīng)典Wnt信號通路的靶基因。經(jīng)典Wnt信號通路的激活能夠?qū)е耊nt蛋白的N末端糖基化的增加，例如Wnt3a和LRP5/6，并且能夠通過這個正反饋環(huán)引起DPAGT1的進一步高表達。這個反饋環(huán)的不適當(dāng)?shù)募せ罹湍軌虼龠M口腔鱗狀細胞癌的增值。
　　 Cthrc1是分泌型的糖基化蛋白，所以我們可以推測，Cthrc1在口腔鱗狀細胞癌中的過表達或許是DPAGT1和Wnt/β信號通路形成的這個反饋環(huán)作用的結(jié)果。并

5、且，Cthrc1可能在口腔鱗狀細胞癌中通過激活Wnt/PCP信號通路來促進腫瘤細胞的遷移和腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　 方法:
　　 在口腔鱗狀細胞癌腫瘤標(biāo)本和人舌鱗狀細胞癌細胞Cal27中我們用western blot和免疫熒光的方法檢測了Cthrc1和DPAGT1的蛋白水平的表達。對Cthrc1進行了去糖基實驗。在cal27細胞中，我們沉默掉DPAGT1基因，然后檢測了Cthrc1蛋白的表達水平。染色質(zhì)免疫沉淀實驗檢測了在Ct

6、hrc1啟動子上β-catenin和TCF的結(jié)合位點。在Cal27細胞中我們沉默掉Cthrc1基因，然后進行了細胞移動實驗和刮傷愈合實驗。
　　 結(jié)果:
　　 在口腔鱗狀細胞癌中Cthrc1表達升高。Cthrc1在很多人類實性腫瘤中表達升高，所以我們在腫瘤標(biāo)本和腫瘤的臨近正常上皮組織中用western blot和免疫熒光的方法檢測了其蛋白表達水平。Cthrc1的表達在腫瘤組織中比正常組織中有非常顯著的增高。在免疫熒光的結(jié)

7、果中我們看到，在腫瘤上皮島中表達升高，而在正常組織中幾乎沒有表達。過去的研究表明，Cthrc1的激活狀態(tài)是一個錨在細胞膜上的N末端糖基化的三聚體，并且N末端的糖基化對其錨在細胞膜上起著重要的作用。所以我們在腫瘤標(biāo)本及正常組織中用western blot和免疫熒光的辦法檢測了DPAGT1的表達，發(fā)現(xiàn)DPAGT1在腫瘤組織里的表達遠遠超過正常組織。并且在免疫熒光中我們看到，在正常上皮組織中DPAGT1僅僅在基底層表達，而在腫瘤組織中則是整個

8、腫瘤上皮島都有高表達。Cthrc1是糖基化蛋白，所以我們進行了去糖基實驗，發(fā)現(xiàn)Cthrc1的激活狀態(tài)確實有N末端糖基修飾。
　　 N末端糖基化能夠增加口腔鱗狀細胞癌中Cthrc1蛋白的穩(wěn)定性。有研究證明N末端糖基化增加了Cthrc1的分泌，也是其錨在細胞膜上的重要因素。為了搞清楚N末端糖基化在Cthrc1過表達中起的作用，我們在cal27細胞中沉默掉了DPAGT1基因，從而使得N末端的糖基化減少。這樣我們發(fā)現(xiàn)在沉默掉DPAGT1

9、基因的cal27細胞中的Cthrc1的蛋白水平嚴(yán)重下降。隨后我們用環(huán)已酰亞胺處理了經(jīng)DPAGT1 siRNA轉(zhuǎn)染的cal27細胞及其對照組，我們發(fā)現(xiàn)N末端的糖基化使Cthrc1的半衰期增加，也就是增加了其穩(wěn)定性。所以我們認為這可能是Cthrc1在口腔鱗狀細胞癌中高表達的一個原因。
　　 經(jīng)典Wnt信號通路的激活也是口腔鱗狀細胞癌中Cthrc1高表達的促進因素。我們過去的研究表明，在口腔鱗狀細胞癌中DPAGT1與經(jīng)典Wnt信號通路

10、形成了一個正反饋的作用環(huán)。在我們的實驗中，經(jīng)過Wnt3a條件培養(yǎng)基培育過的cal27細胞的Cthrc1的表達水平增加。隨后我們在染色質(zhì)免疫沉淀實驗中發(fā)現(xiàn)在Cthrc1的啟動子上有β-catenin和TCF的結(jié)合位點。眾所周知，β-catenin處在經(jīng)典Wnt信號通路的最末端，TCF又是β-catenin的靶基因。所以經(jīng)典Wnt信號通路的激活能夠使Cthrc1的表達升高。這也許是口腔鱗狀細胞癌中Cthrc1蛋白表達升高的另一種機制。

11、>　　 Cthrc1促進了口腔鱗狀細胞癌的遷移。我們大量的觀察發(fā)現(xiàn)，利用DPAGT1cDNA上調(diào)Cthrc1表達之后，在刮傷愈合實驗中傷口邊緣的Cthrc1表達增多和傷口愈合加快，這都說明Cthrc1可能具有促進了細胞遷移的功能。因此我們在Cal27細胞中沉默掉Cthrc1，進行了細胞移動實驗和刮傷愈合實驗。在細胞移動實驗中沉默組細胞移動率比對照組明顯降低，在刮傷愈合實驗中沉默組愈合速度比對照組明顯減慢。這些結(jié)果表明在Cal27細胞中

12、Cthrc1是具有促進細胞遷移的功能的。
　　 DPAGT1轉(zhuǎn)染的CAL27細胞中的Cthrc1在遷移的邊緣位置表達升高的特點說明了Cthrc1的促進細胞遷移的功能是依賴于Wnt/RhoA信號通路的。確實如此，繼western blot之后免疫沉淀實驗表明Cthrc1與Wnt/PCP的配體Wnt5a，受體Fzd6有相互的結(jié)合作用。并且，Wnt5a在腫瘤中表達水平比正常組織中有明顯的增高。所以，這些都說明在口腔鱗狀細胞癌中，Cth

13、rc1可能通過一個非經(jīng)典Wnt信號通路Wnt/PCP信號通路來促進細胞的遷移。
　　 結(jié)論:
　　 我們的結(jié)果證明了N末端糖基化和經(jīng)典Wnt信號通路的激活能夠引起Cthrc1的表達升高，也就是DPAGT1與Wnt/β信號通路形成的反饋環(huán)的異常激活能夠?qū)е翪thrc1在口腔鱗狀細胞癌中的異常高表達。
　　 結(jié)果也間接的說明，Cthrc1可能通過Wnt/PCP信號通路在口腔鱗狀細胞癌的晚期促進癌細胞的遷移，從而導(dǎo)致腫