噬菌體在致病菌檢測中的應用.pdf

1、致病菌的快速、靈敏檢測將為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、疾病的診斷與治療等提供重要科學依據(jù)。建立在抗體特異性識別基礎上的免疫分析方法是致病菌檢測最為常用的方法，然而特異性的單克隆抗體不僅價格昂貴，而且難以獲取。自然界中存在著各種各樣的噬菌體，為細菌的特異檢測提供了一個天然的寶庫。噬菌體能在活的具有感受性的菌體內(nèi)繁殖，并且每種細菌基本都具有特異的噬菌體?；谑删w的寄生專一性以及生長速度快等特點，噬菌體常被用來鑒定一些特定的致病菌。
　　

2、雙砷染料是諾貝爾化學獎獲得者錢永健實驗室研發(fā)的一種適用于活細胞蛋白標記的熒光探針，它是一類含有雙砷基團的有機小分子（如FlAsH-EDT2），能夠穿透細胞膜，與連在重組蛋白標記的六肽標簽CCXXCC序列（簡稱四半胱氨酸TC，其中X是除半胱氨酸外的任意氨基酸）發(fā)生特異性結合，生成強熒光的共價結合的雙砷染料-四半胱氨酸復合物（熒光強度約為FlAsH-EDT2的50000倍）。與其它的蛋白熒光標記方法（如綠色熒光蛋白）相比較，四半胱氨酸六肽標

3、記序列體積小，不會影響被標記蛋白質或細胞的正常生理功能。此外，雙砷染料具有量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性強、標記速度快并且能夠提供除了熒光之外的其它讀出方式等優(yōu)點，是一種更理想的蛋白質熒光探針。
　　 本論文的第一章為緒論，首先對噬菌體在致病菌檢測中的應用進行綜述，隨后對課題研究的相關背景如噬菌體展示肽庫技術、雙砷染料-四半胱氨酸體系進行介紹。
　　 第二、三章主要介紹利用噬菌體對細菌的專一寄生性，建立噬菌體與雙砷染料-四半胱氨酸蛋

4、白標記的聯(lián)合運用體系，發(fā)展新型的致病菌快速鑒別診斷方法。我們首先分別對噬菌體M13和T7進行基因改造，在其外殼上插入四半胱氨酸序列(FLNCCPGCCMEP)。重組噬菌體侵染特異的宿主菌并在其體內(nèi)快速繁殖，噬菌體衣殼蛋白上所表達的四半胱氨酸序列與后續(xù)加入的跨膜雙砷染料共價結合，發(fā)出強烈的熒光信號，使細菌可在傳統(tǒng)流式細胞儀、熒光顯微鏡上進行檢測，擴大了細菌的檢測種類。
　　 第四章是結合噬菌體展示肽庫技術，建立應用于致病菌檢測的雙

5、功能噬菌體探針構建實驗技術平臺。通過重疊延伸PCR定點法突變M13KE質粒的三個位點，在pⅧ基因區(qū)插入PstI和BamHI雙酶切位點，在多克隆區(qū)刪除PstI位點。在突變成功的噬菌體的pⅧ蛋白插入Streptavidin的特異識別序列-VSS片段，作為報告位點，在pⅢ衣殼蛋白中插入O157:H7的H7抗原的識別序列-LHI片段，作為捕獲O157:H7的位點。嘗試使用構建成功的雙功能噬菌體作為探針在傳統(tǒng)流式細胞儀上檢測O157∶H7。

6、>　　 第五章是利用實驗室自行研制的超高靈敏流式檢測儀，發(fā)展噬菌體的絕對計數(shù)方法。我們采用SYTOX Orange熒光染料對噬菌體T7和M13的DNA進行染色，進而在雙通道超高靈敏流式檢測儀(HSFCM)上檢測。HSFCM可以檢測到單個T7和M13的微弱熒光信號，實現(xiàn)了對T7噬菌體的絕對計數(shù)，實驗結果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法有良好的對應關系。
　　 本論文的主要成果是：1、建立了雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體體系，對細菌進行特異性識