血管生成素和核糖核酸酶-4基因表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、核糖核酸酶A超家族是一類可以水解RNA的核酸內(nèi)切酶，其同源基因通常在染色質(zhì)上成簇排列。核糖核酸酶-4（Ribonuclease-4，RNase-4）和血管生成素（Angiogenin，ANG）作為超家族的第四和第五個(gè)成員，它們的基因共享相同的啟動子區(qū)域以及部分5'-非翻譯區(qū)（5'-Untranslate Region，5'-UTR），之后緊隨兩個(gè)獨(dú)立的分別編碼ANG和RNase-4蛋白的外顯子。這種基因排列方式在核糖核酸酶A超家族中是唯

2、一的，并且在整個(gè)基因組中也是非常罕見的。目前，對于這種特殊排列結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍知之甚少。因此，我們利用生物信息學(xué)手段分析了人類ANG和RNase-4基因座位上可能的調(diào)控元件，希望從其調(diào)控元件著手闡明這種特殊基因結(jié)構(gòu)的調(diào)控模式。根據(jù)基因表達(dá)加帽分析（Cap-Analysis of GeneExpression，CAGE）數(shù)據(jù)庫繪制了ANG和RNase-4基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，確定了基因啟動子的位置。進(jìn)一步，通過體內(nèi)的雙熒光素酶報(bào)告基因分析

3、，我們發(fā)現(xiàn)ANG和RNase-4基因的啟動子區(qū)域存在著兩個(gè)活性位點(diǎn)，即遠(yuǎn)端啟動子活性位點(diǎn)(P1)和近端啟動子活性位點(diǎn)(P2)，并且被兩個(gè)tRNA順式作用元件(T1和T2)隔開。其中，遠(yuǎn)端啟動子活性位點(diǎn)P1的啟動子活性被緊隨其后的tRNA順式作用元件T1所抑制，而位于近端啟動子活性位點(diǎn)P2前端的tRNA順式作用元件T1和T2可以顯著增強(qiáng)P2的啟動子活性。tRNA順式作用元件也可以位置依賴性的方式影響猿猴病毒40(SV40)啟動子的轉(zhuǎn)錄活性

4、。除此之外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CTCF(CCCTC-binding factor, CTCF)結(jié)合于ANG蛋白編碼外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子中，從而促使基因內(nèi)染色質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成，并將ANG蛋白編碼外顯子包裹于此結(jié)構(gòu)中，最終促進(jìn)ANG和RNase-4基因的表達(dá)水平。我們的研究結(jié)果為揭示人類ANG和RNase-4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　人類核糖核酸酶A超家族共有13個(gè)成員，每一個(gè)成員都具有其各自特有的生物學(xué)功能，例如宿主防御、血管

5、新生、促進(jìn)\抑制腫瘤生長和激活免疫系統(tǒng)等。ANG是第一個(gè)基于其促血管新生功能從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化的核糖核酸酶，經(jīng)過近30年的研究，對其在生理和病理?xiàng)l件下的作用機(jī)制已經(jīng)有一定了解。已有實(shí)驗(yàn)證明ANG可以與rRNA基因的ABE(Angiogenin Binding Element，ABE)序列結(jié)合并促進(jìn)rRNA的轉(zhuǎn)錄，但是其具體的分子機(jī)制仍不明確。我們通過體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了ANG除了可以與rRNA基因的ABE位點(diǎn)結(jié)

6、合外，還可以結(jié)合于rRNA基因啟動子的UCE（Upstream ControlElement，UCE）位點(diǎn)，通過調(diào)控rRNA基因啟動子區(qū)域的組蛋白修飾（包括組蛋白H4的乙酰化、組蛋白H3的第四位上賴氨酸的二甲基化以及第九位上賴氨酸的二甲基化修飾）以及DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物(Pre-initiation Complex，PIC)的組裝，最終增強(qiáng)rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。除與rDNA區(qū)域結(jié)合外，一般認(rèn)為A

7、NG也可以作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)其它基因的表達(dá)，但ANG是否可以結(jié)合在這些基因的啟動子區(qū)域？本論文通過體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀與啟動子基因芯片篩選相結(jié)合的技術(shù)，繪制了ANG基因組結(jié)合位點(diǎn)圖譜，并且驗(yàn)證了幾個(gè)直接受ANG調(diào)控的基因。
　　RNase-4和ANG是同時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，但是目前RNase-4的生物學(xué)功能仍是一個(gè)謎。我們利用生物信息學(xué)手段分析發(fā)現(xiàn)RNase-4與ANG具有非常一致的基因表達(dá)譜，并且在腫瘤組織中高表達(dá)。同時(shí)，我們課題組

8、的前期工作也證明了RNase-4具有促血管新生、誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育以及在應(yīng)激條件下保護(hù)神經(jīng)元的功能。在此基礎(chǔ)上，本論文探討了RNase-4在腫瘤的生成與發(fā)展過程中的作用，結(jié)果顯示RNase-4在腫瘤組織中高表達(dá)，并且具有促腫瘤血管新生和促進(jìn)腫瘤生長的雙重功能。因此，RNase-4是一種嶄新的促腫瘤生長因子，可能成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。
　　綜上所述，本博士論文研究發(fā)現(xiàn):1.人類ANG和RNase-4基因表達(dá)受tRNA順式作用元件和