小鼠線粒體DNA缺失突變的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)及康欣口服液對(duì)其影響的研究.pdf

1、目的：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠外周血線粒體DNA（mtDNA）的缺失突變，從分子水平揭示以補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血活血法為組方原則的康欣口服液延緩衰老的機(jī)理，為臨床應(yīng)用康欣口服液延緩衰老提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：從老年小鼠外周血DNA分別擴(kuò)增代表mtDNA缺失突變的267bp片段及代表野生型mtDNA的470bp片段，并將其克隆至pGEM-T Easy載體以構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-TEasy/267和pGEM-T Easy/470，

2、以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)10-2～10-5倍比系列稀釋，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以檢測(cè)小鼠外周血mtDNA缺失突變。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)近交系Balb/c青年小鼠（6-8周齡）、中年小鼠（6-8月齡）、老年小鼠（14月齡）外周血mtDNA的缺失突變；選用自然衰老的近交系Balb/c老年小鼠，分為老年空白對(duì)照組（灌胃給予生理鹽水）和老年康欣口服液組（灌胃給予康欣口服液）。四個(gè)月后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)兩組

3、小鼠外周血mtDNA缺失突變。
　　 結(jié)果：從老年小鼠外周血DNA分別擴(kuò)增出了代表mtDNA缺失突變的267bp片段及代表野生型mtDNA的470bp片段，并將其克隆至pGEM-T Easy載體，得到了重組質(zhì)粒pGEM-TEasy/267和pGEM-T Easy/470，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（相關(guān)系數(shù)>0.994）。老年Balb/c小鼠外周血mtDNA缺失突變明顯，而在中年小鼠與青年小鼠外周血mtD

4、NA中未檢測(cè)到相同片段的缺失；與老年空白對(duì)照組比較，康欣口服液能顯著降低老年Balb/c小鼠mtDNA的缺失突變（P<0.05）。
　　 結(jié)論：1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是一種檢測(cè)小鼠外周血線粒體缺失突變的有效方法，該方法敏感性好，特異性高。2.外周血mtDNA的缺失隨年齡增長(zhǎng)而積累，在老年小鼠的外周血mtDNA中可以檢測(cè)到4236bp缺失突變。3.喂服康欣口服液能夠降低老年小鼠外周血mtDNA缺失突變，提示補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血活血法