纖維蛋白支架用于移植修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討纖維蛋白支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化及增殖的影響；評(píng)價(jià)纖維蛋白支架在神經(jīng)組織內(nèi)的生物相容性，觀察支架在體內(nèi)的改建過(guò)程。為纖維蛋白用于構(gòu)建組織工程支架移植修復(fù)脊髓損傷提供可行性研究資料。 方法：1．用培養(yǎng)基將纖維蛋白原制成膠狀溶液，在新鮮鼠血漿中凝血酶的促凝作用下，使其凝固成多孔的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白支架。顯微鏡觀察支架的表面結(jié)構(gòu)，并用電子顯微鏡觀察支架內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)。 2．分別培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓來(lái)源的

2、神經(jīng)干細(xì)胞和新生鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，接種于纖維蛋白支架上，同時(shí)用多聚賴氨酸修飾的玻片作為對(duì)照。于體外培養(yǎng)不同時(shí)間(3天、7天、14天)后，用神經(jīng)絲蛋白(NF200)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，測(cè)量各復(fù)孔(n=4)內(nèi)NF陽(yáng)性細(xì)胞的突起長(zhǎng)度，計(jì)算其平均值；培養(yǎng)14天后，用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染色，各復(fù)孔(n=4)內(nèi)統(tǒng)計(jì)5個(gè)不同視野的膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算GFAP陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的平均值。用免疫印跡技術(shù)對(duì)

3、熒光染色結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。比較在纖維蛋白支架和玻片上神經(jīng)干細(xì)胞分化、神經(jīng)纖維延伸及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖的差異，分析支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化及增殖影響。 3．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺損部位，同時(shí)以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對(duì)照組。動(dòng)物存活不同時(shí)間后，取出支架植入部位的組織，應(yīng)用透射電鏡觀察支架移植部位的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及支架在神經(jīng)組織內(nèi)的降解和改建過(guò)程，評(píng)價(jià)支架的組織相容性。 4．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺

4、損部位，同時(shí)以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對(duì)照組。動(dòng)物存活不同時(shí)間后，取出支架/脊髓組織，用免疫熒光雙標(biāo)和免疫印跡技術(shù)分析損傷部位/支架移植區(qū)的神經(jīng)纖維再生和膠質(zhì)纖維增生情況。評(píng)價(jià)纖維蛋白支架移植對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生及膠質(zhì)瘢痕形成的影響。 5．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺損部位，同時(shí)以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對(duì)照組。分別于術(shù)后4周，8周，12周對(duì)各組動(dòng)物下肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行BBB評(píng)分。比較各組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)程度。評(píng)價(jià)

5、支架移植用于修復(fù)脊髓損傷的效果和臨床應(yīng)用的可行性。 結(jié)果：1．纖維蛋白支架呈半透明多孔海綿狀，質(zhì)地柔軟有彈性。支架縱切面經(jīng)伊紅染色后用光鏡觀察，支架內(nèi)部呈多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用掃描及透射電鏡觀察支架內(nèi)部纖維蛋白纖維的縱、橫切面，具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 2．于體外培養(yǎng)的各觀察時(shí)間點(diǎn)，纖維蛋白支架組的NF陽(yáng)性纖維明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(3天和7天組，P＜0.05；14天組，P＜0.01)；而各時(shí)間點(diǎn)的GFAP的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P

6、＜0.05)。體外培養(yǎng)14天后，支架組GFAP細(xì)胞陽(yáng)性率為23.5％，對(duì)照組為69.1％，支架組的GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)數(shù)量明顯少于對(duì)照組。 3．實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周，仔細(xì)分離移植部位粘連的周圍組織取出整體脊髓，可見(jiàn)脊髓缺損部位移植支架后已完全愈合，局部組織增生，脊髓外觀飽滿完整；對(duì)照組術(shù)后12周，缺損部位有致密的瘢痕增生并與背側(cè)結(jié)締組織粘連，分離周圍組織，取出整體脊髓，可見(jiàn)缺損部位大部分已修復(fù)，局部有暗紅色塌陷區(qū)，整體脊髓外

7、觀欠飽滿。透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組脊髓支架移植部位和對(duì)照組脊髓缺損瘢痕修復(fù)部位的超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)有毛細(xì)血管和有髓神經(jīng)纖維分布；對(duì)照組局部組織內(nèi)存在空洞，空洞內(nèi)有組織碎片和漿細(xì)胞，洞壁細(xì)胞排列緊密。 4．術(shù)后4～12周，支架移植組可見(jiàn)支架內(nèi)有少量神經(jīng)纖維，此后神經(jīng)纖維逐漸增多，而膠質(zhì)細(xì)胞增生不明顯；對(duì)照組脊髓損傷局部可見(jiàn)壞死空洞，空洞周邊膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，支架移植組神經(jīng)絲蛋白(NF200)相

8、對(duì)含量高于對(duì)照組；對(duì)照組膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的相對(duì)含量高于支架移植組。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均具有顯著性差異(P＜0.05)。 5．術(shù)后兩組動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)，但對(duì)照組動(dòng)物恢復(fù)較慢。各觀察時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分，支架移植組均高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1．纖維蛋白支架外觀半透明具有較好的韌性，可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化并有利于神經(jīng)纖維的延伸而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖成熟。