醋甲唑胺對蛛網膜下腔出血小鼠神經功能損害及神經元凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　1、通過神經病學評分及曠場試驗，探討醋甲唑胺對SAH小鼠的感覺運動及認知功能的影響。
　　2、通過FJB染色及TUNEL法檢測出血側腦皮層及海馬的變性和凋亡神經元的變化，探討醋甲唑胺對SAH小鼠神經元凋亡的影響。
　　3、通過免疫組織化學和western blot檢測醋甲唑胺對SAH后凋亡關鍵分子caspase-3蛋白的影響，初步探討醋甲唑胺處理影響SAH后神經元凋亡的分子機制。
　　研究方法：<

2、br>　　1．小鼠SAH模型的建立及分組
　　雄性C57BL/6J小鼠（25-30g）隨機分為假手術組、未用藥組及醋甲唑胺組。用血管內插線法建立小鼠蛛網膜下腔出血模型，激光多普勒血流儀記錄血流量的變化。假手術組穿刺過程僅感到阻力但不穿破血管。醋甲唑胺組術后30分鐘開始腹腔注射醋甲唑胺（20mg/kg），以后每12小時注射一次，一般用藥至處死的各時相點，最長不超過72小時。其余兩組在相同時相注射等量的PBS。
　　2.蛛網膜下

3、腔出血程度的判定
　　對本實驗所有需術后24小時處死的小鼠進行出血評分。術后24h處死小鼠并快速取腦，照相機拍攝腦基底池部出血情況，根據Sugawara等報道的方法進行出血等級判定。
　　3．神經功能損害評分
　　假手術組選5只小鼠作為對照，其余每組隨機抽取9只進行神經功能學評分及曠場試驗。神經功能評價采用Garcia評分系統(tǒng)，總分為5—18分。
　　4.認知功能評價
　　分別在術后第3d、7d、14d進行

4、曠場試驗。每次試驗記錄小鼠在曠場內5 min的行為表現(xiàn)，統(tǒng)計分析其運動總距離及中央格時間。
　　5.腦水腫的檢測
　　假手術組選5只小鼠作為對照，其余每組隨機抽取9只，SAH后24h，麻醉后斷頭處死取腦，迅速秤重，隨后放置在烤爐內，100℃烘烤24小時，再秤重。以公式計算含水量：(濕重一干重)／濕重×100％。
　　6.腦血管痙攣的檢測
　　每組隨機抽取8只小鼠。手術后24h處死小鼠，采用印度墨水/明膠灌注固定腦

5、血管，照相后用Image J軟件進行腦血管直徑的檢測及比較。
　　7．FJB及TUNEL法檢測神經元的變性和凋亡
　　每組隨機抽取9只小鼠，手術后24h，中性多聚甲醛行腦血管灌注后取腦，固定后石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片后FJB法檢測大腦皮層及海馬區(qū)變性壞死神經元的比例；TUNEL法檢測大腦皮層及海馬細胞凋亡的變化。
　　8.免疫組織化學方法檢測大腦皮層及海馬區(qū)的活化型caspase-3的表達及分布情況。
　　9. W

6、estern blot法檢測腦組織caspase-3蛋白的表達，用ImageJ軟件進行半定量分析。
　　10.所有實驗數(shù)據用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
　　1. SAH總死亡率為25.3%，其中假手術組無死亡，未用藥組26.1%，醋甲唑胺組24.4%，未用藥組與醋甲唑胺組死亡率無統(tǒng)計學差

7、異(p＞0.05)
　　2.出血程度方面，假手術組無出血；未用藥組的蛛網膜下腔出血評分為8.50±2.17，醋甲唑胺組為8.09±1.81，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。腦血流量方面，未用藥組和醋甲唑胺組手術過程中各時間點無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　3.神經病學評分，假手術組24h、48h、72h分別為17.5±0.55、18、18，未用藥組分別為10.33±2.55、12.56±2.13、14.11±2.2

8、6，醋甲唑胺組分別為12.67±2.00、14.67±1.66、16.00±1.00，三組組間各時間點比較均有統(tǒng)計學差異。24h、48h、72h醋甲唑胺組好于未用藥組小鼠(P　　4.假手術組3d、7d及14d的曠場試驗運動總距離及中央格時間與未用藥組及醋甲唑胺組比較，有統(tǒng)計學差異。醋甲唑胺組各時間點的運動總距離及中央格時間較未用藥組改善明顯（p＜0.05）；
　　5.在出血側大腦半球，醋甲唑胺組腦含水量(77

9、.78%±0.43%)較未用藥組腦含水量(78.27%±0.48%)減少(P<0.05)；
　　6.三組的大腦前及頸內動脈直徑比較均無統(tǒng)計學差異。未用藥組(87.11±6.73)及醋甲唑胺組(89.39±7.22)的大腦中動脈直徑較假手術組的大腦中動脈直徑(106.89±8.66)明顯變小(PO.05)；
　　7.假手術組偶見FJB陽性細胞，醋甲唑胺組出

10、血側腦皮層及海馬區(qū)FJB陽性細胞數(shù)(40×)分別為30.89±7.08、16.33±7.77，與未用藥組(42.64±11.58、31.55±4.95)比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；
　　8.假手術組偶見TUNEL陽性細胞，醋甲唑胺組出血側腦皮層及海馬區(qū)TUNEL陽性細胞(40×)比值分別為12.14%±8.33%、10.42%±12.92%，與未用藥組(25.84%±9.66%、23.60±7.22%)比較明顯

11、降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；
　　9.假手術組偶見caspase-3免疫陽性表達于胞漿；醋甲唑胺組出血側腦皮層及海馬區(qū)caspase-3陽性細胞(40×)比值分別為20.64%±10.93%、23.67%±9.77%，與未用藥組(44.57%±8.50%、41.96%±16.90%)比較明顯降低，差異統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；
　　10.免疫蛋白印跡結果顯示，假手術組無 caspase-3表達（0.751±0.

12、001），未用藥組caspase-3表達明顯（0.916±0.089），醋甲唑胺組caspase-3表達為0.758±0.007，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
　　結論：
　　1.醋甲唑胺可減輕SAH后的腦水腫，抑制腦皮層和海馬神經元的變性凋亡，早期可改善SAH小鼠的神經功能，遠期可改善SAH小鼠的認知功能。
　　2.醋甲唑胺可能通過抑制凋亡關鍵分子caspase-3的活化表達，抑制神經元的凋亡，從而對SAH后的腦損