稀土鑭化合物調(diào)控核因子κB信號(hào)通路的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景:核因子-κB(NF-κB)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物多種細(xì)胞具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，是細(xì)胞中一個(gè)對(duì)環(huán)境改變發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)節(jié)大量與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和細(xì)胞抗凋亡等相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB活化的失調(diào)參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，例如感染性休克(膿毒癥)、多臟器功能衰竭等燒傷臨床上常見(jiàn)，目前尚缺乏特異的治療方法的并發(fā)癥，而NF-κB在這些并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用；其他如缺血再灌注

2、損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、老年性癡呆、腫瘤細(xì)胞抗凋亡及艾滋病(AIDS)等的發(fā)生和發(fā)展也都與NF-κB的過(guò)度活化直接相關(guān)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)系統(tǒng)受到許多金屬元素的影響。如金、鋅、銅等不同化合物均可通過(guò)抑制IKKs(IκB激酶)的活性來(lái)阻斷NF-KB的活化；金精三羧酸主要通過(guò)強(qiáng)烈抑制NF-κB與DNA結(jié)合來(lái)控制艾滋病毒HIV活性；許多金屬如金、鈀、鎳及汞亦可影響NF-κB與DNA結(jié)合從而調(diào)節(jié)靶

3、基因的激活。鑭是一種化學(xué)性質(zhì)十分活躍的稀土金屬，研究證實(shí)稀土具有抗菌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能等作用。臨床上，稀土已經(jīng)在磁共振、時(shí)間分辨檢測(cè)、放射性同位素診斷中用作診斷試劑，鈰浴法還用于治療燒傷患者；2004年10月，碳酸鑭被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療磷酸水平高的血透患者。前期研究工作證明稀土化合物氯化鑭對(duì)LPS引起的體內(nèi)效應(yīng)有明顯的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)表明鑭可降低內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥介質(zhì)水平，減輕內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體主要臟器的損傷，對(duì)致死量?jī)?nèi)毒

4、素攻擊小鼠具有明顯的保護(hù)作用。本課題擬通過(guò)分析氯化鑭對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)NF-κB上游相關(guān)信號(hào)分子以及NF-κB系統(tǒng)內(nèi)部的信號(hào)分子表達(dá)及活化的影響，并觀察氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB所調(diào)控的下游炎癥反應(yīng)介質(zhì)表達(dá)的影響，探索鑭抑制NF-κB活化的可能機(jī)制，為臨床感染性休克(膿毒癥)、多臟器功能衰竭等疾病的治療提供新思路，并為開(kāi)發(fā)稀土的藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第Ⅰ部分氯化鑭對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)NF-κB上游信號(hào)分子的作用 目的:分析氯化鑭對(duì)

5、LPS誘導(dǎo)NF-κB上游信號(hào)分子的表達(dá)和活化的影響。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：RAW264.7巨噬細(xì)胞：以含5％胎牛血清的DMEM/F12液體培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，分別接種于去熱原培養(yǎng)瓶中及預(yù)先放置無(wú)菌去熱源蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組如下：①LPS組：以含1μg/ml LPS的無(wú)血清DMEM/F12體培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。②氯化鑭＋LPS組：以含

6、氯化鑭2.5μmol/L經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明該濃度可以有效抑制NF-κB的活化)的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞4h后，棄培養(yǎng)基并以無(wú)熱原生理鹽水漂洗細(xì)胞三遍，再加入含1μg/ml LPS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③空白對(duì)照組：培養(yǎng)基為不含血清的DMEM/F12，不加氯化鑭和LPS。④氯化鑭對(duì)照組：以含氯化鑭2.5μmol/L的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。按檢測(cè)指標(biāo)要求分別于不同時(shí)間段收集培養(yǎng)上清、細(xì)胞及細(xì)胞爬片待檢。

7、 2.研究?jī)?nèi)容及方法： (1)觀察氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表面Toll樣受體4(TLR4)基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的作用：利用流式細(xì)胞術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析TLR4基因表達(dá)情況； (2)氯化鑭對(duì)LPS活化NF-κB上游部分信號(hào)通路的影響： ①觀察氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞p38MAPK蛋白表達(dá)和磷酸化的作用：采用細(xì)胞免疫熒光染色分析p38MAPK/p-p38

8、MAPK在巨噬細(xì)胞細(xì)胞中的分布與表達(dá)；免疫印跡技術(shù)測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)p38MAPK蛋白表達(dá)和磷酸化水平的改變。 ②觀察氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中PKC蛋白表達(dá)和磷酸化的作用：采用細(xì)胞免疫熒光染色分析PKC在巨噬細(xì)胞的表達(dá)和磷酸化轉(zhuǎn)位情況；Western blot測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)PKC蛋白表達(dá)和磷酸化水平的改變。 結(jié)論：氯化鑭通過(guò)阻斷NF-κB上游PKC信號(hào)通路，從而可能部分抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。

9、 第Ⅱ部分氯化鑭對(duì)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子活化作用的分析 目的:觀察不同激活機(jī)制下(激活物分別為L(zhǎng)PS及TNFα，靶細(xì)胞分別為RAW264.7及Hela細(xì)胞及NF-κB組成性活化細(xì)胞株U266)，氯化鑭對(duì)各細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)和磷酸化及NF-κB/p65亞基與靶基因結(jié)合能力的影響，探索氯化鑭抑制NF-κB活化的可能作用位點(diǎn)。 研究方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組 (1)RAW264.7

10、細(xì)胞：(同上)。 (2)Hela細(xì)胞：以1×106個(gè)/ml接種細(xì)胞于含10％胎牛血清的RMPI 1640液體培養(yǎng)基中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，隨機(jī)分組如下：①TNFα組：以含TNFα20ng/ml的無(wú)血清RMPI 1640液體培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞。②氯化鑭＋TNFα組：分別以含氯化鑭5，25，50和100μmol/L的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞4h后棄培養(yǎng)基并以無(wú)熱原生理鹽水漂洗細(xì)胞三遍，再加入含TNFα2

11、0ng/ml的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③空白對(duì)照組：培養(yǎng)基為不含血清的RMPI 1640，不加氯化鑭和FNF α。④氯化鑭對(duì)照組：以含氯化鑭100μmol/L的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞。各組細(xì)胞根據(jù)檢測(cè)方法的要求分別培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板(孔中預(yù)先放置無(wú)菌蓋玻片)或培養(yǎng)瓶中，于，30min后，收集培養(yǎng)上清、細(xì)胞及蓋玻片待檢。 (3)U266細(xì)胞：以1×106個(gè)/ml接種細(xì)胞于含15％胎牛血清的RMPI 1640液體培養(yǎng)基的培

12、養(yǎng)瓶中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，隔天半量換液，實(shí)驗(yàn)分組如下：①空白對(duì)照組：培養(yǎng)基為不含血清的RMPI 1640,不給予任何干預(yù)和刺激。②氯化鑭對(duì)照組：分別以含氯化鑭2.5，5，25，50和100μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)U266細(xì)胞。各組細(xì)胞根據(jù)檢測(cè)方法的要求分別培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，30min后收集培養(yǎng)細(xì)胞待檢。 2.檢測(cè)指標(biāo) (1)Western blot技術(shù)測(cè)定IκB上游激酶IKK α，IKKB的

13、表達(dá)和磷酸化情況； (2)Western blot技術(shù)測(cè)定胞漿提取物中IκBα蛋白表達(dá)和磷酸化水平； (3)細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)分析NF-κB/p65蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和分布； (4)Western blot技術(shù)測(cè)定胞核提取物中NF-κB/p65蛋白表達(dá)水平； (5)Transcription Factor Assay kit試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA))測(cè)定胞核提取物中p65蛋白與DNA靶序列

14、結(jié)合能力。 研究結(jié)果提示：對(duì)于NF-κB組成性活化U266細(xì)胞，氯化鑭不影響IKKβ的磷酸化及IκB α的磷酸化和降解，并無(wú)法逆轉(zhuǎn)NF-κB轉(zhuǎn)位，但能夠在細(xì)胞外條件下阻斷NF-κB/p65與靶DNA的結(jié)合。 第Ⅲ部分氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB調(diào)控的炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響 目的:通過(guò)觀察氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF α、NO及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá)水平及活性的作用，了解氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB

15、下游靶基因表達(dá)的影響。 研究?jī)?nèi)容和方法: (1)實(shí)驗(yàn)分組：(同第Ⅰ部分)。 (2)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定TNF α及iNOS基因表達(dá)水平。 (3)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)測(cè)定細(xì)胞上清中TNF α含量。 (4)細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)分析iNOS蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和分布。 (5)Western blot技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平。 (6)硝酸還原酶法檢測(cè)

16、培養(yǎng)上清NO含量。 結(jié)果和結(jié)論: (1)氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB下游炎癥介質(zhì)TNFα表達(dá)和釋放的抑制作用：2.5μmol/L氯化鑭不僅能夠下調(diào)靜息狀態(tài)下巨噬細(xì)胞TNFα基因的表達(dá)和多肽的釋放還能夠顯著抑制LPS上調(diào)TNF α基因表達(dá)和多肽釋放。 (2)氯化鑭對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB下游基因iNOS表達(dá)的抑制作用：2.5μmol/L氯化鑭能明顯下調(diào)iNOSmRNA的表達(dá)水平，減少iNOS蛋白的生成，顯著降低產(chǎn)物