血管內皮功能障礙中醫(yī)辨證分型標準的建立與絡氣虛滯型血管內皮功能障礙的病理生理機制及通絡藥物干預研究.pdf

1、目的：本研究以絡病理論為指導，建立血管內皮功能障礙的中醫(yī)證候量化辨證分型標準，并在此基礎上建立絡氣虛滯型血管內皮功能障礙病證復合動物模型和細胞模型，探討“絡氣虛滯”狀態(tài)下血管內皮功能障礙變化、神經(jīng)內分泌免疫(NEI)網(wǎng)絡調控紊亂及兩者的內在聯(lián)系，同時觀察病證復合模型動物血清對內皮細胞骨架的纖維狀肌動蛋白(F-actin)及單層內皮細胞通透性的影響，研究絡氣虛滯對內皮細胞的作用并探索不同類別通絡藥物的作用機制，為絡病理論指導血管病變防治提

2、供科學依據(jù)。 方法： 1. 血管內皮功能障礙中醫(yī)辨證分型標準的建立 通過文獻調研、專家咨詢、中醫(yī)四診信息的分級賦分確立“血管內皮功能障礙中醫(yī)證候臨床調查表”，并進行臨床流行病學調查。納入標準：①年齡40歲以上；②至少具備下列診斷中的一項：單純高血壓、血脂異常、超重或肥胖、吸煙、代謝綜合征人群；③一氧化氮(NO)<59 umol/L，及內皮素(ET)>53.38 pg/ml。排除標準：①心、腦、腎、神經(jīng)、眼底等靶器

3、官損傷者；②嚴重肝、腎功能不全者；③妊娠或哺乳期婦女、精神病患者。調查由專人負責，用Epidata3.0建立數(shù)據(jù)庫。將400例入選病人，隨機分為甲、乙兩組，甲組300例，乙組100例，甲組用于建立量化辨證分型標準及對量化辨證分型標準進行回顧性檢驗，乙組用于量化辨證分型標準的前瞻性檢驗。將甲組300例臨床調查資料，采用基于熵的復雜系統(tǒng)分劃方法對數(shù)據(jù)進行處理分析，按癥狀聚堆結果，提取血管內皮功能障礙各證型的中醫(yī)癥狀信息，歸納各證型，并計算各

4、證型中的癥狀對相應證型的貢獻分值，采用診斷性試驗中的接受者操作特性曲線(ROC曲線)分析方法，結合專業(yè)知識，確定各證型的診斷閾值。根據(jù)臨床流行病學診斷性試驗研究方法，進行量化辨證分型標準的回顧性和前瞻性檢驗。分析各證型之間的關聯(lián)度，歸納各證型組合規(guī)律及病機轉趨規(guī)律。 2. 絡氣虛滯型血管內皮功能障礙模型的建立及通絡藥物干預研究 依據(jù)上述臨床流行病學調查確立的辨證分型標準，以中醫(yī)“勞則氣耗”、“饑則損氣”理論為指導，在高蛋

5、氨酸(HCY)飲食建立血管內皮功能障礙大鼠模型基礎上，疊加“基礎進食+強迫負重游泳”絡氣虛滯證候因素建模。將清潔級雄性Wistar大鼠隨機分為以下7組，每組15只：(1) 對照組；(2) 血管內皮功能障礙模型組(HCY組)；(3) 復合模型組(絡氣虛滯證候+HCY)；(4) 人參(復合模型+人參)；(5) 四味通絡組(復合模型+四味通絡方)；(6) 通心絡組(復合模型+通心絡超微粉)；(7) 貝那普利組(復合模型+貝那普利)。從模型大鼠

6、的生物學表征、血管內皮病理組織形態(tài)學、血管內皮的生化功能等方面對模型進行綜合評價，同時運用單味藥物(人參)、組分配伍藥物(四味通絡方)、復方通絡藥物(通心絡)干預，并與貝那普利進行對照研究，觀察不同層次通絡藥物對復合模型的作用。 3. 絡氣虛滯型血管內皮功能障礙模型大鼠NEI網(wǎng)絡變化及通絡藥物干預研究 本研究應用絡氣虛滯型血管內皮功能障礙病證復合大鼠模型，通過檢測交感-腎上腺髓質系統(tǒng)：血清去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(

7、E)的水平(ELISA法)；下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)：血漿促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)和血清皮質酮(CORT)的水平(放射免疫分析法)；腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)：血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)的水平(放射免疫分析法)；免疫系統(tǒng)：血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)的水平(放射免疫分析法)等，反應NEI網(wǎng)絡的功能變化。運用典

8、型相關分析，對NEI網(wǎng)絡相關因子與內皮功能相關指標：ET、NO、血管性假血友病因子(vWF)進行相關性分析，并觀察通絡藥物的干預作用。 4. 病證復合模型大鼠血清培養(yǎng)HUVEC建立細胞模型并觀察細胞骨架蛋改變及通絡藥物干預研究 采用絡氣虛滯型血管內皮功能障礙病證復合模型大鼠血清培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)細胞株，激光共聚交顯微鏡觀察細胞骨架

9、蛋白F-actin的形態(tài)、分布，流式細胞儀檢測F-actin含量、伊文思藍標記牛血清白蛋白檢測單層內皮通透性變化，Western blot技術檢測HUVEC細胞骨架蛋白F-actin、p38、磷酸化p38(phospho-p38，p-p38)蛋白表達和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路變化及通絡藥物干預作用。實驗細胞分組:(1) 對照組:無血清培養(yǎng)基(F12

10、K)中加入終濃度為20％的胎牛血清:(2) 正常血清組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20％的正常大鼠血清；(3) 復合模型血清組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20％的復合模型大鼠血清；(4) 人參組:于無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入人參(終濃度:1μg/ml)孵育，2h后加入20％復合模型大鼠血清；(5) 四味通絡組:于無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入四味通絡方(終濃度:100μg/ml)孵育，2h后加入20％復合

11、模型大鼠血清。(6) 通心絡組:于無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入通心絡超微粉(終濃度:1μg/ml)孵育，2h后加入20％復合模型大鼠血清；(7) SB203580組:于無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入SB203580(p38阻斷劑，終濃度:25umol/L)孵育，1h后加入20％復合模型大鼠血清。加入血清后各組培養(yǎng)時間為2h、6h、12h、24h四個時間點。 結論： 1. 首次建立血管內皮功能障礙中醫(yī)證候量化辨證分型

12、標準 在國內首次采用臨床流行病學調查方法，將基于熵的復雜系統(tǒng)分劃方法應用于血管內皮功能障礙中醫(yī)證候辨證分型標準的研究。研究結果顯示，該方法適用于中醫(yī)證候辨證標準的研究，為中醫(yī)證候的標準化、規(guī)范化研究提供了新思路與新方法。首次建立了血管內皮功能障礙的中醫(yī)證候量化辨證分型標準，本病可分為絡氣虛滯、絡氣郁滯兩大基本證型，同時可兼夾痰濕、郁熱、陰虛、陽虛、痰熱、血瘀等證。絡氣郁滯或虛滯在血管內皮功能障礙中占有重要地位。 2. 建

13、立絡氣虛滯型血管內皮功能障礙病證復合動物模型 依據(jù)臨床流行病學調查確立的辨證分型標準，以中醫(yī)“勞則氣耗”、“饑則損氣”理論為指導，在高蛋氨酸飲食建立血管內皮功能障礙模型基礎上，疊加“基礎進食+強迫負重游泳”，成功建立了絡氣虛滯型血管內皮功能障礙病證復合大鼠模型，為深入研究其病理生理機制提供了可靠的基礎。 3. 絡氣虛滯型血管內皮功能障礙模型大鼠存在NEI網(wǎng)絡調控紊亂并與血管內皮功能障礙密切相關 復合模型大鼠NEI

14、網(wǎng)絡相關因子存在異常改變，具體表現(xiàn)為交感神經(jīng)-腎上腺髓質系統(tǒng)功能亢進、HPAA功能抑制、RAAS功能亢進和免疫系統(tǒng)細胞因子IL-1β升高、IL-2下降，提示復合模型大鼠存在NEI網(wǎng)絡調控紊亂。絡氣虛滯證候因素在復合模型大鼠NEI網(wǎng)絡調控紊亂中起著重要作用。典型相關分析顯示，復合模型大鼠血管內皮功能障礙相關指標與NEI網(wǎng)絡相關因子之間具有相關性，具體反映在NO、vWF和ACTH、NE、CORT、IL-2、CRH之間互相影響。上述研究提示，

15、NEI網(wǎng)絡調控紊亂可能是絡氣虛滯型血管內皮功能障礙發(fā)生、發(fā)展的病理生理學機制之一。 4. 首次建立絡氣虛滯型血管內皮功能障礙細胞模型 采用病證復合大鼠模型血清培養(yǎng)HUVEC，模擬病證復合損傷因素對內皮細胞的影響。結果顯示，復合模型內皮細胞骨架蛋白F-actin含量降低、解聚和重新分布，單層細胞通透性增高，其機制可能與p38 MAPK信號通路激活有關。 5. 通絡藥物對血管內皮功能障礙的整合調節(jié)作用 不同類

16、別的通絡藥物干預，均可明顯改善復合模型大鼠絡氣虛滯證候表現(xiàn)，減輕血管內皮細胞的形態(tài)損傷，調整內皮細胞相關因子的變化；改善交感神經(jīng).腎上腺髓質系統(tǒng)、HPAA、RAAS、免疫系統(tǒng)的功能紊亂。其中以復方通心絡作用最明顯，提示不同通絡藥物的科學組方在保護內皮功能方面發(fā)揮出整合調節(jié)優(yōu)勢。 體外實驗研究證實，復方通心絡可改善F-actin的形態(tài)與分布，提高F-actin含量，進而降低內皮通透性，保護血管內皮，其機制與抑制p38MAPK信號通