骨髓增生異常綜合征線粒體DNA D-loop區(qū)突變研究.pdf

1、目的:本研究以42例骨髓增生異常綜合征患者及11例由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的骨髓標本為研究對象，提取其線粒體DNA，針對mtDNA D-loop區(qū)的兩個高變區(qū)(HV1區(qū)和HV2區(qū))設計引物并進行PCR擴增，通過直接測序法對所擴增的基因序列進行檢測，研究不同類型的MDS患者mtDNA突變的特征與規(guī)律，從而探討mtDNA突變在MDS發(fā)病及疾病轉(zhuǎn)化中的地位和意義。 方法:選擇齊魯醫(yī)院血液科就診的42例MDS患者，其中男17例，女2

2、5例，年齡25～62歲(中位年齡51歲)；4例MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者，其中男2例，女2例，年齡47～62歲(中位年齡56歲)。收取其骨髓液，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝，同時收取其口腔上皮正常組織。提取基因組DNA，用PCR技術擴增線粒體DNA D-loop區(qū)的兩個高變區(qū)。低溶點膠法回收PCR產(chǎn)物，用T載體克隆PCR純化產(chǎn)物并將含目的片段的菌液送測序。將所測線粒體DNA D-loop區(qū)的HV1區(qū)和HV2區(qū)基因序列與劍橋標準序列(revis

3、ed Cambridge reference sequence，rCRS)進行對比。在骨髓標本中與劍橋序列不一致的位點再與同一患者的口腔上皮正常組織的序列比較，若此位點的變化在口腔上皮組織中未出現(xiàn)，則定義為突變；若在骨髓標本和口腔上皮中均出現(xiàn)，則定義為多態(tài)，在數(shù)據(jù)庫(MITOMAP、mtDB和GenBank)沒有記錄的認為是新的多態(tài)位點。 結果: 1、瓊脂糖凝膠電泳結果：成功擴增出mtDNA D-loop區(qū)兩個高變區(qū)序列，瓊脂糖

4、凝膠電泳分別在470bp和490bp處出現(xiàn)特異條帶。 2、MDS患者mtDNA多態(tài)性改變：在42例MDS患者骨髓標本中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變199個，其中在HV1區(qū)(360bp)131個，單個標本中最少發(fā)現(xiàn)1個，最多發(fā)現(xiàn)7個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.87％；HV2區(qū)(316bp)共68個，單個標本最少0個，最多5個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.51％。未發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點。 3、MDS患者mtDNA的突變：在42例MDS患者骨髓標本中有6例

5、檢測到突變，突變位點共19個，計算突變率為14.29％。突變類型為堿基置換突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失。其中5個微衛(wèi)星不穩(wěn)定(HV1區(qū)4個，HV2區(qū)1個)，這中間有4個是poly-C片段中C核苷數(shù)目的增加。其余14個突變位點均為A、G或者C、T之間的堿基置換(HV1區(qū)6個，HV2區(qū)8個)。 4、由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的mtDNA多態(tài)性改變：在4例MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變21個，其中在HV1區(qū)13個

6、，單個標本最少發(fā)現(xiàn)2個，最多4個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.90％；HV2區(qū)8個，單個標本最少1個，最多3個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.63％。未發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點。MDS組和急性白血病組多態(tài)性發(fā)生頻率無差異(P>0.05)。 5、由MDS轉(zhuǎn)化的急性白血病患者的mtDNA突變：在4例急性白血病患者骨髓標本中有3例檢測到突變，突變位點共4個，計算突變率為：75％，突變類型為堿基置換突變和堿基缺失。兩組突變發(fā)生頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

7、。 結論:在MDS患者中骨髓造血細胞凋亡過度是引起無效造血的主要原因，而誘導凋亡的信號多數(shù)引起線粒體功能的改變，使線粒體內(nèi)膜通透性增加，膜電位破壞，促使細胞色素C的釋放，從而觸發(fā)caspase級聯(lián)反應，引起凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)MDS患者中mtDNA D-loop區(qū)有較高的突變率，由于mtDNA重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄啟動子以及重鏈的復制起始位點均位于D-loop區(qū)，因此D-loop區(qū)的突變將會影響到mtDNA的復制和轉(zhuǎn)錄，直接影響線粒體編碼