弧菌屬16S核糖體RNA基因特異引物的設計優(yōu)化及其在膠州灣海洋弧菌菌群結構分析中的應用.pdf

1、弧菌是海洋環(huán)境中最常見的細菌類群之一。弧菌屬的一些種是致病菌，能引起海洋生物弧菌病，以水產(chǎn)品為中間宿主，一些弧菌可引起人類腹瀉、菌血癥和外傷感染，嚴重時可以致死。弧菌是條件致病菌，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)弧菌病的發(fā)生與水體中弧菌的總數(shù)無線性關系，而是由弧菌屬的結構組成——即致病菌的數(shù)量決定的。目前弧菌多樣性的研究仍局限在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的技術路線上；由于環(huán)境微生物宏基因組復雜度高，現(xiàn)有技術的分析容量有限，基于UPPCR的16SrRNA分子多樣性研究只能

2、在較高的分類階元進行分析，而不能準確描述某一屬甚至科內的多樣性構成。因此，突破傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術限制，在分子水平上研究環(huán)境樣品中弧菌屬的組成和弧菌菌群動態(tài)變化對于水產(chǎn)養(yǎng)殖安全和食品安全有著重要意義。 DNA提取是整個環(huán)境微生物基因組研究的基礎，能否獲得具有代表性的DNA將決定后續(xù)分析的可信性。本研究第一部分介紹了一種制備海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——堿煮法。使用該方法制備的模板DNA溶液pH值在8到9之間，可直接用于核糖體

3、RNA、葉綠體rbcL和線粒體COI等基因的PCR擴增。第二部分中，以16SrRNA基因為指示基因，結合弧菌屬的近緣種序列，利用引物3’端2-4個堿基特異性起始PCR反應的性質，在弧菌屬16SrDNA的保守區(qū)設計特異引物VF169，VR744和VR1150。根據(jù)引物對的嚴謹性和弧菌屬內通用性設計不同組合，通過特異PCR選擇性擴增環(huán)境樣品中弧菌屬16SrDNA片段并構建16SrDNA序列變異類型文庫；隨機篩選克隆進行測序(共測序72個)，

4、構建系統(tǒng)樹分析膠州灣近岸水體中弧菌屬的組成。另外，通過菌株擴增實驗和序列的BLAST分析驗證了引物的特異性和弧菌屬內通用性。 研究結果表明，設計的引物VR744表現(xiàn)出很強的弧菌屬特異性，同時可以擴增絕大多數(shù)已知弧菌菌種，配合細菌通用引物VF27可從環(huán)境樣品總DNA選擇性擴增弧菌屬16SrDNA；系統(tǒng)學分析顯示72個序列都與已知的弧菌屬細菌的序列聚類，具有很高的相似性，可以推斷秋季膠州灣海域弧菌復雜度較高，類燦爛弧菌群是其中的優(yōu)勢