攜帶人內皮抑素基因腺病毒質粒的構建及相關功能的研究.pdf

1、研究背景 子宮內膜異位癥(Endometriosis，簡稱內異癥或EMs)是一種雌激素依賴性疾病，其真正的病因和發(fā)病機制還不明確。目前臨床上治療的主要目標只局限于減輕疼痛，提高妊娠率以及盡可能的延遲疾病復發(fā)，尚不存在針對病因治療的藥物，疾病也無法得到根治。腹腔鏡手術治療內異癥，是目前外科治療的方法之一，但在輕中度病變、不孕和復發(fā)患者中手術的價值還存在爭議。在內異癥發(fā)病機制的研究中，目前普遍接受的觀點是1927年Sampson等提

2、出的“種植學說”，指出異位灶必須在新生血管的支持下才能維持內膜的生存和發(fā)展。血管生成機制已成為內異癥公認的重要發(fā)病機制之一。 內皮抑素(Endostatin)是目前已知最強的內源性血管形成抑制因子，它能特異地抑制血管內皮細胞增殖，這預示著其在內異癥治療中具有的巨大潛力。 目前對于內皮抑素用于抗腫瘤血管生成的研究備受關注，且其蛋白治療在國外已進入到Ⅱ期臨床試驗階段，但由于內皮抑素蛋白質結構不穩(wěn)定，半衰期短，需多次重復給藥，

3、且其生產(chǎn)工藝復雜，這些都大大限制了其應用。如果能采取基因治療的策略，使機體本身變成一個生產(chǎn)內皮抑素蛋白的“工廠”，就可能徹底解決上述問題。腺病毒載體的應用為內皮抑素實現(xiàn)基因治療提供了一個很好的途徑，被廣泛地應用于體外基因轉導、體內接種疫苗和基因治療等各個領域。 目的 為深入研究內皮抑素在子宮內膜異位癥治療中的療效，我們擬構建包含人內皮抑素(hEndostatin)基因的缺陷型腺病毒質粒，利用相應的包裝細胞系，制備具有感染

4、能力的腺病毒顆粒，去感染與血管生成密切相關的血管內皮細胞，觀察對內皮細胞的影響，驗證并探討其功能和作用機制，為進一步研究內皮抑素在子宮內膜異位癥動物模型上的治療作用打下基礎。 方法與結果 1．用基因工程方法獲得人內皮抑素基因，設計特定限制性酶切位點，將內皮抑素基因插入缺陷型腺病毒載體中。構建的重組質粒經(jīng)測序驗證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精

5、氨酸，與GenBank中人內皮抑素蛋白質序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達。 2．將重組腺病毒質粒線性化后通過Lipofectamine 2000轉染HEK293T細胞，得到包含人內皮抑素基因的完整腺病毒顆粒，通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后，用OD260法測定其病毒滴度為5.2×10<'9>pFU/mL。 3．利用構建好的重組人內皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304臍靜脈內皮細胞，western

6、blot測定hEndostatin蛋白的表達情況，流式細胞術檢測Ad-hEndo引起ECV-304細胞凋亡的情況，繪制Ad-hEndo感染后的ECV-304細胞生長曲線。與對照組相比，病毒感染48小時后檢測到明顯的hEndostatin蛋白表達，流式細胞術證實Ad-hEndo在感染3d后出現(xiàn)ECV-304細胞凋亡，細胞生長曲線監(jiān)測顯示ECV-304細胞在Ad-hEndo感染后生長受到明顯限制。 結論 通過構建包含人內皮抑