骨髓間充質(zhì)干細胞促進腎臟缺血再灌注損傷修復的實驗研究.pdf

1、目的：急性腎功能衰竭(Acuterenalfailure，ARF)是臨床常見之危重癥，死亡率較高，目前治療方面仍缺乏有效的手段。缺血再灌注損傷引起的急性腎小管壞死是ARF的常見病因，其病理特征為腎小管梗阻、腎小管濾過液回漏和濾過功能障礙。因此促進腎小管上皮的再生和腎小管結(jié)構(gòu)的重建是治療ARF的關(guān)鍵。本實驗應用缺血再灌注腎臟勻漿和全反式維甲酸對大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymlstemcells，MSCs)進行誘導，探討體外誘導

2、Mscs向腎小管上皮樣細胞分化的可能性；同時對缺血再灌注腎臟損傷的大鼠行MSCs靜脈移植治療，觀察MSCs在大鼠體內(nèi)的分布情況以及對腎臟修復的促進作用。 方法： 1.體外實驗：采用梯度離心和貼壁篩選法分離純化MSCs，取第三代的MSCs進行誘導。在MSCs的培養(yǎng)液中加入全反式維甲酸，終濃度為5μM；同時將裝有缺血再灌注損傷大鼠腎臟勻漿的插入式嵌合培養(yǎng)皿置于MSCs的培養(yǎng)板中，以此對MSCs進行誘導，分別于Od、3d、5d

3、、7d時對誘導的MSCs細胞進行大體形態(tài)學觀察、超微結(jié)構(gòu)觀察、細胞組織化學染色、胞漿內(nèi)第18型角蛋白(CKl8)流式細胞儀測定。 2．體內(nèi)試驗：選用72只雌性6周齡SD大鼠進行動物實驗。隨機將大鼠分為四組：1)正常對照組(n=6)：觀察正常大鼠血液學指標和。腎組織結(jié)構(gòu)；2)假手術(shù)對照組(n=6)：行開腹手術(shù)，而不夾閉腎蒂；3)缺血再灌注(I瓜)組(n=30)：夾閉腎蒂45min，建立雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型，再灌注60min后

4、，股靜脈輸注生理鹽水；4)骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)組(n=30)：夾閉腎蒂45min，建立雙側(cè)腎臟缺血再灌注損傷模型，再灌注60min后，股靜脈輸注經(jīng)5一溴脫氧尿嘧啶核苷(BmU)標記的MSCs細胞懸液(1×106/mD。分別于再灌注后12h、3d、7d、14d、42d隨機選取I瓜組大鼠和MSCs組大鼠各6只，麻醉下收獲腎臟標本和血標本。血標本經(jīng)全自動生化分析儀測定腎功能指標尿素氮和肌酐值：所有腎臟標本常規(guī)病理切片，用HE、PAS染

5、色觀察組織學變化，TUNEL法檢測原位凋亡，免疫組化法檢測細胞增殖情況，激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs分布及分化情況。 結(jié)果： 1．體外實驗：MSCs經(jīng)誘導后大體形態(tài)變?yōu)閳A形、橢圓形或短胖梭形，細胞逐漸呈鵝卵石樣排列。經(jīng)誘導的細胞CKl8表達陽性率于Od、3d、5d、7d分別為3．27％、20．5％、38．4％、79．5％，陽性率逐漸升高。誘導第7d細胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)微絨毛和緊密連接。MSCs未經(jīng)誘導時堿性磷酸酶(ALP)染

6、色陽性率為5％，誘導第7d，札P染色明顯增強，陽性率為723％。 2．體內(nèi)試驗：再灌注后12h、3d，MSCs組S盯值分別為66．35士23．89pmol/L、34．89±7．19μmol/L與I/R組(分別為146．45士33．74μmol/L、103．8士55．73μmo兒)相比明顯降低(P<0．05)，MSCs組BUN值分別為23．32±4．35mmo兒、6．48士2．25mmo兒與I/R組(分別為31．3士3．93mmo

7、l幾、23．5士12．43mmo兒)相比明顯降低(P

8、Cs組PCNA陽性細胞數(shù)分別為42．53±7．10、36．43士10．72、49．93士7．61較I/R組(9．87±3．97、lO．10±539、17．8±4．77)明顯增多(P