組織工程化膀胱體內血管化的實驗研究.pdf

1、由于轉基因細胞合成分泌的內源性蛋白表達產(chǎn)物活性高，能有效的同細胞表面受體結合，免疫排斥反應小，副作用小，為了探索轉基因細胞在組織化膀胱體內血管化的應用，我們將VEGF165 cDNA 克隆于真核表達載體pcDNA3.1(-), 構建真核表達載體pcDNA3.1(-)/VEGF165；采用電轉化方法將含VEGF165 的真核表達質粒轉染入鼠膀胱平滑肌細胞，用RT-PCR 檢測VEGF165 基因在鼠膀胱平滑肌細胞中的表達，并用MTT 法檢

2、測轉染后細胞上清液中VEGF165 的生物學活性。結果顯示將構建的真核表達載體pcDNA3.1(-)/VEGF165 轉染入鼠膀胱平滑肌細胞后，VEGF的表達增高，轉染后細胞上清液具有促使內皮細胞增殖的生物學活性。 為進一步了解所轉染的膀胱平滑肌細胞在動物體內的促血管生成作用，我們將種植了轉染VEGF 的膀胱平滑肌細胞體外培養(yǎng)后，移植至大鼠體內，并以膀胱缺損自然愈合和單純植入SIS 為對照進行觀察，于術后10 周內每隔2 周取

3、標本進行組織學和免疫組化檢測CD34 和VEGFR2 的表達，觀察支架植入物的組織生長和修復情況，結果顯示膀胱缺損自然愈合組的大鼠術后1 周時膀胱缺損區(qū)已有膀胱移行上皮形成，第2 周時新生的膀胱粘膜已覆蓋缺損區(qū)。在植入SIS 的兩組動物中，術后1 周時炎性細胞浸潤明顯，可見膀胱移行上皮形成；術后2 周時炎性細胞減少，單純SIS 植入組和轉染VEGF 組均可見完整的上皮形成，兩組未見明顯的差異；此時已有新生毛細血管，VEGF 受體的表達呈

4、陽性，且轉染VEGF組中新生毛細血管數(shù)量和VEGF 受體的陽性表達細胞數(shù)高于單純SIS 植入組（P<0.05）；術后4 周時新生毛細血管形成較第2 周時明顯增多（P<0.05），但兩組間新生毛細血管數(shù)和VEGF 受體表達陽性細胞數(shù)未見顯著性差異（P>0.05），同時兩組可見少量平滑肌纖維形成；術后6 周以后平滑肌形成逐漸增多，到第10 周時可見明顯的平滑肌束，兩組間新生毛細血管數(shù)和VEGF 受體表達陽性細胞數(shù)未見顯著性差異（P>0.05

5、）。 盡管文獻報道制備的小腸粘膜下層中含有少量細胞生長因子, 但尚不明確其在動物體內是否仍具有生物活性，為了解小腸粘膜下層在膀胱組織修復中外源性生長因子VEGF和bFGF 釋放，我們用ELISA 法和MTT法體外測量凍干SIS 在PBS 孵育液中VEGF 和bFGF 的含量及對上皮細胞的增殖作用；用豬小腸粘膜下層（SIS）行大鼠膀胱部分修復。術后在不同時間觀察大鼠膀胱修復情況，并用組織學免疫組化方法觀察VEGF和bFGF 的表

6、達, 單純大鼠粘膜及部分肌層缺損組作為對照。結果顯示凍干SIS 在PBS 孵育液中VEGF 含量約為121.8±2.683ng/L; bFGF 含量約為93.8±3.033ng/L，且對上皮細胞有增殖作用；組織學顯示移植的SIS 上可見新生毛細血管和平滑肌肌束。免疫組化顯示實驗組和對照組VEGF 和bFGF 在術后第1 周均呈弱陽性表達，第2 周以后實驗組VEGF 和bFGF表達逐漸增強，至第6 周達到高峰，第8 周VEGF 和bFGF