TLR2和TLR4活化的骨髓間充質(zhì)干細胞對人臍血CD34+細胞遷移能力的影響以及差異表達的MicroRNAs及其在TLR信號通路中的調(diào)控作用.pdf

1、背景和目的：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體，在天然免疫及獲得性免疫過程中均發(fā)揮非常重要作用。研究表明，TLR同樣表達于多種非免疫細胞，并發(fā)揮一定生物學效應(yīng)。前期工作中我們已證實，人骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）表達 TLR2和TLR4，并參與MSC調(diào)控的造血支持功能。作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分，MSC在造血干細胞的動員和

2、歸巢中發(fā)揮重要作用。微小RNA（microRNAs）是通過介導mRNA降解或抑制靶基因的翻譯參與各種生物學功能。本研究利用TLR2激動劑（PAM3CSK4）和TLR4激動劑（LPS）體外活化人骨髓來源的MSC，首先觀察 TLR2和/或 TLR4活化的MSC分泌的上清對人臍血CD34+造血干祖細胞遷移能力的影響；其次鑒于Toll樣受體的活化在細胞增殖，分化，遷移和BM-MSC的造血支承功能方面的重要作用，進一步對這些過程的分子機制進行探討

3、，初步闡明TLRs是否調(diào)控人骨髓來源的MSC的微小RNA的表達量以及TLR2/4活化后差異表達的miRNAs在調(diào)控MSC在上述過程中的作用。
　　方法：應(yīng)用Ficoll法體外分離培養(yǎng)健康供者的骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（BM-MSC），流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面CD29、CD44、CD49e、CD90、CD105、CD166，CD14、CD34、CD31、CD45和HLA-DR以及健康供體骨髓源性間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)表

4、面 TLR2和TLR4的表達情況。TLR2激動劑(PAM3CSK4)和TLR4激動劑(LPS)預活化人骨髓源性間充質(zhì)干細胞（MSCs），分別收集培養(yǎng)上清和細胞。MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出新鮮臍血的CD34+造血干祖細胞，趨化實驗測定MSCs培養(yǎng)上清對人臍血 CD34+細胞的趨化作用；了解TLR2或（和）TLR4的活化對BM-MSC誘導CD34+細胞遷移活性的影響。ELISA法定量檢測培養(yǎng)上清中趨化因子SDF-1的分泌水平。上述收集的細胞

5、，應(yīng)用Trizol試劑提取出的各組總RNA，用于制備miRNA的測序文庫，該文庫隨后在Illumina Hiseq2000測序儀上測序，修剪讀取的數(shù)據(jù)（長度>=15nt）在miRBase19.0中進行對比注釋，應(yīng)用在線靶基因預測軟件對差異表達的已知的miRNA的潛在靶基因進行預測，為了進一步了解靶基因的功能，對預測的靶基因進行了基因本體論項目的分析，同時為了識別在代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導途徑中顯著富集的靶基因，進而也進行了 KEGG通路分析。

6、qRT-PCR隨機驗證差異表達的miRNA。
　　結(jié)果：人骨髓MSC培養(yǎng)至第三代，流式細胞儀檢測顯示，骨髓MSC表面表達CD29、CD44、CD49e、CD90、CD105和CD166，不表達CD14、CD34、CD31、CD45和HLA-DR。符合MSC的形態(tài)和表型特征。人骨髓來源的MSC表面表達TLR2（31.5±4.6）％和TLR4（85.6±6.7）%。與未加培養(yǎng)上清的空白組相比，對照組、LPS和/或PAM3CSK4活化的

7、MSCs的培養(yǎng)上清對CD34+均有明顯趨化作用（p＜0.01）。進一步研究顯示，與未加激動劑的對照組（MSCs上清組）相比，LPS組、PAM3CSK4組、LPS和PAM3CSK4聯(lián)合刺激組的MSCs培養(yǎng)上清誘導CD34+細胞的遷移作用均有顯著促進作用（p＜0.05）。但LPS組、PAM3CSK4組、LPS和PAM3CSK4聯(lián)合刺激組的培養(yǎng)上清中，SDF-1濃度與對照組相比未見明顯變化（p＞0.05）。llumina Hiseq2000高

8、通量測序的結(jié)果顯示LPS和PAM3CSK4誘導的miRNAs表達發(fā)生了顯著地變化，與對照組相比，LPS組有67個差異表達的miRNAs，其中35個表達顯著上調(diào)，32個表達顯著下調(diào)；PAM3CSK4組有97個差異表達的miRNAs，其中46個表達顯著上調(diào)，51個表達顯著下調(diào)。GO分析表明，預測的靶基因富集到信號轉(zhuǎn)導，細胞過程，調(diào)控大分子代謝過程等各個方面，KEGG途徑提示這些潛在的靶基因參與了許多重要的途徑，主要包括MAPK信號通路，P1

9、3-Akt信號通路，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和腫瘤的通路。qRT-PCR驗證隨機的抽取的40個已知的差異表達的miRNA以及6個新的miRNA結(jié)果顯示與llumina Hiseq2000高通量測序的結(jié)果在上調(diào)和下調(diào)的步調(diào)上均保持一致。
　　結(jié)論: TLR2和/或 TLR4的活化可顯著增強骨髓MSCs誘導的人臍血CD34+細胞的遷移作用，但與趨化因子SDF-1無明顯關(guān)系，同時我們的研究明確了TLR2和TLR4活化的BM-MSC中miRN