鼻咽癌中EB病毒編碼的miRNAs及其宿主靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和初步驗(yàn)證.pdf

1、鼻咽癌是一種與EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相關(guān)的鼻咽上皮惡性腫瘤，然而EBV促進(jìn)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制還沒有完全闡明。最近有證據(jù)指出一類由EBV編碼的微小RNA(microRNA，miRNA)分子可能參與了EBV介導(dǎo)的鼻咽上皮惡性轉(zhuǎn)化，從而影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)EBV可編碼25個(gè)miRNAs前體，加工成44個(gè)成熟的miRNAs，且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布，可以分為B

2、ART和BHRF1兩組。但鼻咽癌中對(duì)于EBV編碼miRNAs的研究還不是很透徹，44個(gè)成熟的EBV miRNAs中大部分還沒有功能研究的報(bào)道。
　　為了確定EBV編碼的miRNA如何調(diào)控宿主基因的表達(dá)，了解EBV miRNA在鼻咽上皮惡性轉(zhuǎn)化中潛在的作用機(jī)制，本課題構(gòu)建了鼻咽癌和正常對(duì)照組織中EBV編碼的全部44個(gè)成熟miRNAs的表達(dá)譜;對(duì)這些EBV miRNAs和它們潛在的宿主靶基因進(jìn)行分析，構(gòu)建了EBV miRNA和它們宿主

3、靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后，從中挑選了EBV miRNAs BART10及其靶基因BTRC進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　1、構(gòu)建EBV miRNAs的表達(dá)譜通過Real-time PCR技術(shù)檢測了鼻咽癌、正常對(duì)照組織及相關(guān)細(xì)胞系中EBV編碼的miRNAs表達(dá)水平，同時(shí)檢測了兩個(gè)EBV編碼的蛋白表達(dá)基因LMP1和EBNA1以作為參照。所檢測的樣品包括16例鼻咽癌活檢組織（其中臨床TNM分期第Ⅱ期5例，Ⅲ期5例，Ⅳ期6例）、5例正常對(duì)照組織（來

4、自鼻咽慢性炎癥患者活檢標(biāo)本）及5株細(xì)胞系（EBV陰性的鼻咽上皮永生化細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞HK-1，EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞C666-1、淋巴瘤細(xì)胞Raji及狨猴B細(xì)胞B95-8）。發(fā)現(xiàn)正常鼻咽上皮組織和EBV陰性的細(xì)胞系中，均檢測不到EBV編碼miRNAs及LMP1、EBNA1的表達(dá);而16例鼻咽癌組織及EBV陽性細(xì)胞系中，都有BART組40個(gè)EBV miRNAs及LMP1、EBNA1的表達(dá)，其中14例鼻咽癌組織為高表達(dá);BHRF1組

5、miRNAs則僅在B細(xì)胞來源的細(xì)胞系Raji及B95-8中有表達(dá)，在上皮來源的組織和細(xì)胞（不論是正常鼻咽上皮還是鼻咽癌）中均不表達(dá)。
　　2、預(yù)測EBV miRNA的宿主靶基因由于BHRF1組的miRNAs在鼻咽癌及對(duì)照組織中均不表達(dá)，我們只對(duì)BART組的EBV miRNAs利用TargetScan和RepTar兩個(gè)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行了宿主靶基因的預(yù)測;TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)BART組EBV miRNAs共有5569個(gè)潛在的

6、宿主靶基因，而RepTar預(yù)測了6494個(gè)BART組EBV miRNAs潛在的宿主靶基因，其中兩個(gè)軟件共同預(yù)測出的潛在宿主靶基因有3140個(gè)。EBV BART組40個(gè)成熟miRNAs中，BART-18-5p有148個(gè)潛在的宿主靶基因，數(shù)目最多，而BART-8、BART-13*和BART-19-3p則沒有預(yù)測到潛在的宿主靶基因。將這3140個(gè)潛在的宿主靶基因輸入DAVID軟件中進(jìn)行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因涉及axon guidance

7、、pathways in cancer、the Wnt signalingpathway、regulation of the actin cytoskeleton及adherens function等信號(hào)通路。
　　3、EBV miRNAs潛在宿主靶基因與鼻咽癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析盡管我們預(yù)測了EBV BART組miRNAs可能調(diào)控3140個(gè)宿主靶基因的表達(dá)，但生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果需要實(shí)驗(yàn)證據(jù)的進(jìn)一步支持和驗(yàn)證。大多數(shù)情況下miR

8、NAs是其靶基因的負(fù)調(diào)控因子，由于EBVBART組miRNAs在鼻咽癌中都是表達(dá)上調(diào)的，那么它們的宿主靶基因理論上將表達(dá)下調(diào)。為此，我們利用SAM軟件重新分析了本實(shí)驗(yàn)室已有的鼻咽癌全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組織相比，鼻咽癌中有732個(gè)基因的表達(dá)顯著失調(diào)，其中上調(diào)基因270個(gè)，下調(diào)基因462個(gè)。將462個(gè)鼻咽癌中顯著下調(diào)的基因與預(yù)測出的3140個(gè)EBVmiRNAs潛在宿主靶基因進(jìn)行比較，最后發(fā)現(xiàn)105個(gè)基因在鼻咽癌中顯著下調(diào)，且它

9、們的mRNA也被兩個(gè)生物信息學(xué)工具TargetScan和RepTar同時(shí)預(yù)測到具有EBV miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)，因此這105個(gè)基因最有可能是EBV miRNAs在鼻咽癌細(xì)胞中真正的宿主靶基因。
　　4、繪制EBV miRNA和宿主靶基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)我們對(duì)這105個(gè)在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)且具有EBV miRNAs結(jié)合位點(diǎn)的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)40個(gè)EBV BART miRNAs中有28個(gè)miRNAs至少靶向這105個(gè)基因中的一個(gè)，

10、其中BART-22有37個(gè)靶基因、BART-8*有23個(gè)、BART-18-5p有12個(gè)、BART-9和BART-14各有11個(gè)靶基因。類似的，有些基因如ATRX、BTRC、CTBP2、FOXP1和NFIB等在它們mRNA的3'-非翻譯區(qū)有多個(gè)EBV miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)。在這105個(gè)宿主基因和28個(gè)EBV BART miRNAs中我們一共找到了175個(gè)miRNA:mRNA對(duì)，為了充分展示EBV miRNAs和宿主基因mRNA間的調(diào)控關(guān)

11、系，我們利用Pajek軟件繪制了它們間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。
　　5、初步驗(yàn)證BTRC是EBV miRNA BART-10的靶基因本研究室曾朝陽副研究員等通過全基因組表達(dá)譜分析并經(jīng)組織微陣列大樣本驗(yàn)證了鼻咽癌中WNT信號(hào)通路的異常激活與EBV的感染密切相關(guān)，本課題中我們發(fā)現(xiàn)WNT通路中關(guān)鍵分子BTRC是EBV miRNAs的潛在靶基因，且在鼻咽癌中顯著下調(diào)，因此本課題中我們初步驗(yàn)證了EBV miRNAs對(duì)BTRC的調(diào)控。盡管BTRC基因3

12、'-非翻譯區(qū)預(yù)測有多個(gè)EBV miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)，我們經(jīng)過初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有EBV miRNA BART-10對(duì)BTRC的調(diào)控作用最為明顯。在鼻咽癌和正常對(duì)照臨床樣本中，我們發(fā)現(xiàn)EBV miRNA BART-10與BTRC的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān);在鼻咽癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染EBV miRNABART-10的mimics后，通過Real-time PCR和Western blotting我們?cè)趍RNA和蛋白水平都驗(yàn)證了EBV miRNA BART-1

13、0能下調(diào)內(nèi)源性BTRC的表達(dá);最后，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)我們證實(shí)了EBVmiRNA BART-10確實(shí)可以靶向BTRC mRNA的3'-非翻譯區(qū)直接調(diào)控該基因的表達(dá)。以上結(jié)果表明在鼻咽癌中BTRC下調(diào)的原因很可能就是受到EBV miRNA BART-10的調(diào)控，并進(jìn)一步通過BTRC下游信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
　　綜上所述，本課題繪制了一個(gè)全面的EBV編碼miRNAs的表達(dá)譜，并通過生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合鼻咽癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)